免疫球蛋白G ( IgG) 片段的水解（一）

基本方案1   木瓜蛋白酶水解IgG 成Fab 片段摸索性试验

此法适用于小鼠（任何亚类）、大鼠、人、山羊、绵羊、马、鸡、豚鼠和牛的 IgG 水解。

材料

• 保存于 PBS 中的 2mg/ml 纯化的lgG
• 木瓜蛋白酶
• 水解缓冲液：0. 02mol/L EDTA （ 二钠盐） / 0. 02mol/L 半胱氨酸／PBS （新鲜配制，冰上保存<10h)
• 溶于PBS 的0. 3mol/L 碘乙酰胺
• PBS
• 自制的微量透析槽或微量透析盒

流程

1. 将100μl 2mg/ml 纯化的IgG 加入标有1~24 的24 个微量离心管中。充分混匀木瓜蛋白酶悬液，不能振荡。准备两种浓度木瓜蛋白酶，溶于5ml 水解缓冲液中，浓度分别是0.1mg/ ml 和0. 02mg/ml 。
2. 将100μl 0.1mg/ ml 木瓜蛋白酶液分别加入8 个IgG 离心管中（酶／抗体比例为1 : 20)，将100μl 0.02mg/ml 木瓜蛋白酶液分别加入第二组8 个IgG 离心管中（酶／抗体比例为1 : 100) ， 最后，将100μl 不含木瓜蛋白酶的水解缓冲液加入剩余的8 个lgG 离心管中（对照组），所有离心管盖上盖子。
3. 将所有离心管置于37°C 水浴，在不同时间取出一组离心管，制作水解时间曲线图。一组离心管指一个E/A 比为1 : 20 的水解管， 一个E/A 比为1: 100 的水解管和一个对照水解管。水浴 1h 时取出第一组离心管， 接着在第2h 、4h 、6h、12h、18h 、24h 和 48h 分别取出第二至第八组离心管。取出一组离心管后每管加入20μl 0.3mol/L 碘乙酰胺中止水解。
4. 用自制的微量透析槽或商品化的微量透析盒将水解混合物对PBS 透析。
5. 用150mmX 1. 5mm 10 ％ 非还原SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分析水解产物，上样量为80μl 。当凝胶上在150kDa （表示未水解的抗体）和120kDa （表示仅半胱氨酸起作用）处没有显示蛋白质条带时， 酶切反应完全。选择水解IgG 获取Fab 片段的最佳试验条件，按基本方案2 进行试验。
   Fab 片段大小为5 0kDa 左右， Fe 片段大小为27kDa, 在24 kDa 和15kDa 处的细条带是一些不重要的水解产物。