英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
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问题 |
可能原因 |
解决方法 |
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放射自显影片空白
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DNA 聚合酶失活 标记物太旧
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用对照引物、模板及试剂进行试验
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试剂太旧
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替换缺陷试剂 |
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不正确或有缺陷的引物
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不正确或有缺陷的模板,
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曝光失误（如保留了保鲜膜，凝胶对着胶片的背面等 |
改正错误 |
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整张放射自显影片太亮／标记物掺入不足 |
标记物太旧
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采用新标记物
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酶活性太低
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采用新的酶制剂，在临用前才稀释并置于冰上
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引物与模板复性不好
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将引物复性温度最优化。如果选用双链模板，记住在复性前一定要碱变性
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引物量不够
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用对照DNA模板和引物进行试验，检测引 物的浓度。使用单链模板时需引物0.5 pmol, 双链模板需1 pmol
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模板量不够
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用对照DNA 模板和引物进行试验，用凝胶 检测模板浓度，每组反应用约0.5 pmol 模板DNA
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曝光或放射自显影失误
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重新曝光，必要时更换显影试剂移去保鲜膜 |
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所有泳道背泉都较高 |
DNA 模板不纯 |
检查对照DNA 是否存在同样的问题。如没 有，重新制备新的模板；如果是双链模板，用RNA 酶A 处理，酚抽提，乙 醇沉淀；必要时，用CsCl 提纯 DNA |
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整个泳道中条带全部扩散或模糊 |
DNA 模板不纯
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检查对照DNA 是否存在同样的问题．如没 有，重新制备新的模板。如果是双链模板，用RNA 酶A 处理，酚抽提，乙醇沉淀，必要时，用CsCl 提纯DNA
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聚丙烯酰胺凝胶质量差
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用高质量的试剂配制新的丙烯酰胺、亚甲双丙烯酰胺及缓冲液。储液保存于4℃暗处
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凝胶灌制后不久就使用
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让凝胶聚合更长时间
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凝胶中缓冲液的浓度与电泳槽中的浓度有差异
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从同一1OX TBE 储液出发，配制凝胶及电泳液
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样品煮沸过度
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如果样品将在多块凝胶中加样．从反应混合物中分别取3 μl 小份样品加热并上样
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样品在电泳前未经变性
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95’C 水浴加热样品2~3 min
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在太高温度下进行凝胶电泳 |
用温度计监测凝胶温度，保持在65°C 以下，必要时，在稍低的电压下电泳以保持低温 |
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凝胶部分区域条带模糊 |
凝胶或凝胶上的塑料包装膜有皱纹 |
详见测序胶罐装方式 |
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胶片没有与凝胶夹紧 |
在凝胶背面插入滤纸以填充X 射线片盒的多余空间，必要时，多用些夹子 |
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在凝胶450~550核苷酸处的所有条带扭曲 |
样品中含有＞0.5 ％甘油 |
用不含甘油的稀释液稀释DNA 聚合酶 |
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整块胶所有的4 条泳道上均同时出现条带 |
酶活性低 |
用新的酶制剂，临用前才用合适的稀释液或1X 测序缓冲液稀释 |
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缓冲液或核苷酸混合物有误 |
配制新的混合物试剂 |
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试剂被污染 |
配制新的试剂 |
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条带间隔失常；条带丢失两、三个泳道的同一位置上同时出现条带，但仅见于特定区域 |
压缩（在凝胶电泳条件下新合成DNA链的二级结构所致） |
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整块凝胶上均见不只一个泳道的同一位置上出现条带 |
DNA 制剂中含有2 种不同的DNA 分子，这些分子产生重叠序列 |
重新从单菌落或单个噬斑中制备新的DNA |
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引物复性于模板的第二位点 |
调整引物／模板的比例及复性温度 |