细胞融合与杂交瘤分选

材料

• SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞系（药物标记的非分泌型； ATCC)
• 添加10mmol/L HEPES 和1mmol/L 丙酮酸钠的DMEM- 10 和DMEM-20 完全焙养基
• 免疫的实验动物：小鼠、大鼠或仓鼠（在初次接种后10~14d 备用)
• 50% （m/V) PEG 溶液，无菌
• DMEM 完全培养基，未添加血清
• 氯化铵溶液： 0. 02mol/L Tris • Cl , pH7. 2 / 0.14mol/L NH₄Cl
• 添加10mmol/L HEPES 、1mmol/L 丙酮酸钠、1XHAT 或1X HT 的DMEM-20完全培养基
• 70% （V/V) 乙醇，仅用于容器消毒
• 175cm² 组织培养用细颈瓶
• 倒置显微镜
• 400ml 和600ml 烧杯（各3 只）
• 100mm 有盖培养皿
• 尖头镊和解剖剪
• 细网金属筛
• 50ml 塑料锥底离心管，无菌
• Beckman 离心机和TH-4 转子或同等设备
• 96 孔平底微量滴定板
• 1ml 和10ml 移液管

实验步骤

1. 细胞融合前一周，开始在添加HEPES 和丙酮酸钠的DMEM- 10 完全培养基中培养SP2 /0- Ag14 骨髓瘤细胞系（融合用细胞） 。在细胞融合操作前骨髓瘤细胞对于不同的实验动物应达到以下水平（每个175cm² 培养瓶含培养液100ml ) ： 小鼠， 1 X 10⁸个细胞／瓶， 2 或3 瓶；仓鼠， 2 X 10⁸ 个细胞／瓶， 3 或4 瓶；大鼠， 5 X10⁸~1X 10⁹个细胞／瓶， 10 瓶。
两个小鼠或仓鼠，或一个大鼠的脾即可满足细胞融合的需要。

2. 细胞融合前3d ，进行二次免疫。

3. 细胞融合前1d , 转移SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞至新鲜的添加HEPES 和丙酮酸钠的DMEM- 10 完全培养基中。

4. 在细胞融合前，用倒置显微镜确定SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞生长良好（折光力强，未固缩），未污染（没有明显的细菌或真菌迹象），并且生长足量。如果骨髓瘤细胞不符合这些要求则暂不进行细胞融合。

5. 将以下物品于37°C 预热：
3 个400ml 以及3 个600ml 烧杯，每个烧杯内盛100ml 水；
20ml 无菌的未加血清的DMEM 完全培养液；
5 ml 无菌的50 % PEG 溶液。

6. 处死二次免疫的实验动物。不要用麻醉法处死动物。对于小鼠，应用颈椎脱臼法，对于大鼠和仓鼠应用二氧化碳窒息法， 取脾脏。

7. 将脾脏移至预置了10ml 无菌的未加血清的DMEM 完全培养液的100mm 培养皿中。
以下操作要求在层流罩中超净工作台完成。

8. 使用尖头镊压辗或解剖剪将脾组织剪碎，移去组织碎片并通过细网金属筛进一步分离细胞，制成单细胞悬液。

9. 将脾细胞悬液移至已消毒的50ml 塑料锥底离心管， 并用无血清DMEM 完全培养液加满离心管（不要使用含有蛋白质或HEPES 的培养液） 。室溫下， TH-4 离心机中500g 离心5min ，弃上清。

10. 在5ml 氯化按溶液中将细胞沉淀重悬以裂解红细胞。在室温下静置5min, 加入45ml 无血清DMEM 完全培养液，如步骤9 进行离心。

11. 加入50ml 无血清DMEM 完全培养液，将沉淀重悬，并再次离心。重复添加DMEM 和离心1次，以完成2 次洗涤。

12. 在洗涤脾细胞的同时，将SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞移入50ml 塑料锥底离心管。如步骤9 进行离心，分离细胞。在DMEM 中重悬细胞，如步骤11 洗涤骨髓瘤细胞3 次。

13. 分别在10ml 无血清DMEM 完全培养液中重悬脾细胞和骨髓瘤细胞。用细胞计数器和台盼蓝拒染试验对两种细胞悬液进行细胞计数和活力测定 。此时两种细胞悬液应该都具有100 ％ 的细胞活力。

14. 在细胞计数的基础上，以约2. 5 X 10⁶个总细胞数／ml 计算培养细胞所需添加HEPES 和丙酮酸钠的DMEM-20 培养基的量。37°C 水浴预热此培养基。取96 孔平底微量滴定板做好标签备用，每10ml 细胞悬液需准备一个孔板。

15. 将SP2/0-Ag14 骨髓瘤细胞与脾细胞以1 : 1 (V/V) 的比例在50ml 塑料锥底离心管中混合。以无血清DMEM 完全培养液加满离心管。室温下， 500g 离心5min。

16. 在进行细胞离心的同时，在层流罩中准备三个600ml 烧杯（步骤5) ，内盛75 ~100ml 37°C 温水，再将3 个内盛100ml 37°C 温水的400ml 烧杯分别放入600ml 烧杯中， 形成水浴环境。将预热的50% PEG 溶液试管与无血清DMEM 完全培养液试管（步骤5) 分别放入2 个37°C 水浴中。

17. 吸取并丢弃混合细胞离心的上清部分（步骤15) ，并将离心管置于第三个水浴烧杯中。使用1ml 移液器向混合细胞沉淀中加入1ml 预热的50% PEG, 在1min 内匀速逐滴缓慢加入，每加入一滴即用移液器轻轻搅匀细胞。滴加完成后轻轻搅匀1min。

18. 使用干净的移液管向混合细胞液中逐滴加入预热的无血清DMEM 完全培养液， 加入的同时轻轻搅匀：
1min 内匀速滴加1ml DMEM;
1min 内匀速滴加1ml DMEM;
2~3min 内匀速滴加7ml DMEM （使用10ml 移液管） 。
注意， 此时应有肉眼可见的细胞团漂浮。室温下， 500g 离心5min 。

19. 在进行细胞离心的同时，将水浴烧杯重新加热到37°C ，并放入层流罩。将预热的添加HEPES 和丙酮酸钠的DMEM-10 完全培养基放入水浴。

20 . 弃上清（步骤18) ，将试管放入水浴。用干净的10ml 移液管将预热的添加HEPES和丙酮酸钠的DMEM- 10 完全培养基用力吹入细胞沉淀。连续添加，直到将所有培养基加入步骤14 准备的培养基。如果培养基体积超过了50ml, 小心地吸取多余量转入其他无菌容器，如培养瓶。如果必要， 可用移液管头压碎细胞团。此后，不需继续保待细胞悬液于恒温水浴中。

21. 小心地用10ml 移液管吸取10ml 细胞悬液（不要使用粗糙的或重复使用的移液管）。小心地在96 孔平底微批滴定板的每个孔中滴加2 滴(100~ 125μl) 细胞悬液。所有细胞悬液滴加完后，用一支干净的移液管除去过多的细胞悬液。37°C 过夜培养。
为了最大程度地减少成纤维细胞的过度生长，可加入一个可选步骤：在移种到96 孔板之前，可以将完成融合的细胞悬液在培养瓶中培养过夜，以除去贴壁生长的成纤维细胞。

22. 培养一天后，在倒置显微镜下检查细胞生长情况。移种了合适数量细胞的孔底部将出现成片的单层高活力细胞或细胞团。

23. 用10m l 移液管在每个孔中滴加2 滴添加HEPES、丙酮酸钠和HAT 的DMEM-20完全培养基混合液。每块孔板需更换不同的移液管头，并保证板盖不被互换，之后将孔板置于培养箱。

24. 如果孔板发生污染， 将其丢弃。或者， 如果污染仅限制在1 或2 个孔中，按以下步骤操作：用消毒的巴氏滴管吸取受污染的孔内容物， 移入空培养瓶。用70％乙醇漂洗这些孔，并用已消霉棉签擦拭。重复洗涤2 次。用蘸有70 ％乙醇的棉签擦拭周围。当有其他孔板在层流罩中时，不要打开受污染的孔板。

25. 于培养的第2 、3 、4 、5 、7 、9 、11 天，用已消毒的小号巴氏滴管吸取每个孔的一半培养液，移入空培养瓶。操作时将滴管保持45°倾斜，贴近培养上清的表面吸取。每个孔板需使用不同的滴管。加入添加HEPES、丙酮酸钠和HAT 的DMEM-20完全培养基混合液（步骤23) ，放回孵箱。如果在第2 天和第3 天没有发现明显的细胞死亡迹象，用加有HAT 的培养液培养部分原骨髓瘤细胞，以检测两者的质量。

26. 培养4d 后，根据孔中的实际细胞数量、融合效率和杂交瘤的外观及生长情况来决定是否更换培养基。避免孔中液体变成黄色（酸性）并持续1d 以上。即使不需要更换培养液也应每天检查孔板，并在出现酸性迹象前更换培养液。

27. 培养第14 天，改用添加HEPES 、丙酮酸钠和HT 的DMEM-20 完全培养液培养细胞，放回培养箱培养。

28 . 培养第15 天直至最后，改用不添加HAT 或HT 的含有HEPES 和丙酮酸钠的DMEM-20 完全培养液。当大多数孔内细胞生长到占孔底面积的10%~25 ％时，可以进行杂交瘤筛选。对于生长特别稠密的孔，可以在换液后2d , 培养液变黄时进行细胞筛选（ 一般情况下，小鼠－小鼠细胞或大鼠－小鼠细胞融合后10~14d, 仓鼠－小鼠细胞融合后需14~21d ) 。
如果在筛选检测中需用³H-胸腺嘧啶核苷摄入试验， 至少需要更换3或4 次不添加HAT 或HT 的含有HEPES 和丙酮酸钠的DMEM-20 完全培养液，稀释残留的胸腺嘧啶核苷以不影响之后的标记。