用测序酶进行标记／终止测序反应常见问题

问题

可能的原因

解决办法

四条泳道同一个位置都有条带，特别是靠近引物的地方

DNA 模板不纯

观察对照DNA 是否存在同样问题，如果不存在，重新制备模板DNA

试剂不纯或试剂老化；dNTP量不足

准备新鲜试剂

DNA 聚合酶活性低

使用新鲜制备的酶。 加入更多的酶，如每个反应多加4 倍。使用前再稀释酶． 将标记反应缩减至2 min, 将T7DNA 聚合酶从模板上的解离降至最低

在胶上低于某一位置的条带很亮，但高于此位置的很暗

模板的二级结构阻止标记步骤中的延长

改变标记反应的条件，使延长不达到二级结构位置： ①在标记混合物中降低3 种dNTP 浓度，如稀释4 倍； ②将标记反应时间降至1 ~ 2 min;③将DNA 浓度提高2~3 倍使用另一种聚合酶（甚至是另一种实验方案）以提高反应温度，如耐热聚合酶加入0. 5 μg大肠杆菌单链DNA 结合蛋白到标记反应中， 以帮助聚合酶在合成时通过二级结构。加入甲酰胺／染料终止溶液后，通过使用 0. 1 μg蛋白酶K 在65℃温育20 min 来除去结合蛋白

胶底部的条带太暗

接近胶底部的已经终止延长部分太少

降低标记混合物的浓度，如稀释3~5 倍。将标记反应时间降低至1~2 min。提高DNA 浓度2~3 倍， 在终止反应中降低dNTP／ddNTP的比率，如将ddNTP 浓度提高2 倍。使用位于此测序位置更上游的引物

胶上部的条带太暗

在DNA 片段达到适当长度之前，聚合酶正在掺入ddNMP

在标记反应中提高标记混合物的浓度（如使用“长“混合物）

在终止反应中，提高dNTP/ddNTP 比率，如在每个终止混合物中、将ddNTP 浓度降低两倍

可以测到序列的条带范围太窄（放射活性仅限于200 个核苷酸的范围）

测序反应中的DNA 浓度低

在测序反应中将DNA 浓度提高到2 μg