单层细胞的培养

材料

• 装在冷冻培养瓶中的细胞： BS-C-1  、CV-1  、HuTK- 143B 或BHK-21 细胞
• 70% (VIV) 乙醇
• 起始和维持培养基（表1) ， 37°C
• PBS （可选）
• 胰蛋白酶／EDTA： 0. 25% (m/V) 胰蛋白酶／0. 02% (m/V) EDTA, 37℃
• 25 cm²和150 cm²组织培养瓶
• 湿润的、37°C 、5% CO₂培养箱

表1 用于细胞系生长和维持的培养基^a

细胞系	维持培养基	起始培养基
BHK-21	完全MEM-10	完全MEM-20
BS-C-1	完全MEM-10	完全MEM-20
CEF	完全MEM-10	完全MEM-10
CV-I	完全的DMEM-10	完全的DMEM-20
HelaS3	转瓶完全培养基－5	完全MEM-10
HuTK- 143B	完全MEM-10/BrdU	完全MEM-20/BrdU

1. 在37°C 水浴中融化一支冷冻细胞的培养瓶，用70％乙醇将瓶口消毒，用移液管将细胞移入一个25 cm² 的组织培养瓶（装有5 ml 起始培养基）中，转动培养瓶，使细胞均匀地分布，放入湿润的5% CO₂培养箱中37°C 培养过夜。
   
2. 吸出起始培养基，换成维持培养基，将细胞放回培养箱内，每天检查细胞的汇合度。
   
3. 当细胞长成汇合的单层时，吸出培养基，用PBS 或胰蛋白酶／EDTA 洗涤一次细胞，以除去残留的血清．
   
4. 用足量的37℃胰蛋白酶／EDTA 刚好覆盖细胞单层（如一个25 cm² 的组织培养瓶用 0.3 ml) ，静置30~40 s, 摇动培养瓶，使细胞完全分开。
   
5. 加入1. 4 ml 维持培养基，用吸管来回吹打细胞悬液几次，以分散细胞团块（这些细胞可用于传代）。
   
6. 取0.5 ml 细胞悬液，将其加到一个新的150 cm2 组织培养瓶（含有30 ml 维持培养基）中，转动培养瓶，使细胞均匀地分布，放入37℃ 的CO₂ 培养箱中，直到细胞汇合（约1 周），大约每间隔一周按约1: 20 的比例分到维持培养基中来维持细胞。