PCR、RT-PCR、qRT-PCR实验精髓

PCR

PCR是很多科研者进入实验室做的第一个分子实验，名字听起来很高级，其实操作起来流程还是比较清晰明了，容易上手。聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction），简称PCR，用于放大特定的DNA片段，也可看作生物体外的特殊DNA复制。其中使用的Taq酶是1976年从温泉中的细菌分离出来的。它的特性在于能耐高温，是一个很理想的酶。PCR最初的原始雏形概念是类似基因修复复制，而后随着Mullis提出新的应用，PCR技术在生物科研和临床应用中得以广泛应用，Mullis也因此获得了1993年诺贝尔化学奖。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性–退火–延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板–引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性–退火–延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

RT-PCR

逆转录-聚合酶链反应大概是我们接触到的第二个PCR技术。原理是：提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。该技术主要用于：分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

相对PCR来说，这个实验主要是增加了模板的获取过程。操作SOP按照说明书即可。

这个实验需要的注意事项：

1. 在实验过程中要防止RNA的降解，保持RNA的完整性。在总RNA的提取过程中，注意避免mRNA的断裂。

2. 为了防止非特异性扩增，需要设阴性对照。

3. 内参的设定：主要为了用于靶RNA的定量。常用的内参有G3PD（甘油醛-3-磷酸脱氢酶）、β-Actin（β-肌动蛋白）等。其目的在于避免RNA定量误差、加样误差以及各PCR反应体系中扩增效率不均一各孔间的温度差等所造成的误差。

4. PCR不能进入平台期，出现平台效应与所扩增的目的基因的长度、序列、二级结构以及目标DNA起始的数量有关。故对于每一个目标序列出现平台效应的循环数，均应通过单独实验来确定。

5. 防止DNA的污染：①采用DNA酶处理RNA样品；②在可能的情况下，将PCR引物置于基因的不同外显子，以消除基因和mRNA的共线性。

qRT-PCR

实时荧光定量（qRT-PCR）则可能是我们接触的第三个PCR实验。无论是刚进实验室的新手还是已经操作多年的老手，都时不时需要用这个技术来进行基因表达情况测定、转基因的检测、突变体基因的鉴定、组织差异性表达等。对于熟练的师兄师姐，可能带着耳机，在有节奏的枪头吸打声中就做出了完美的曲线。但是大部分第一次做这个实验的人，面对的可能是满屏黄标，而且并不清楚这些值代表什么，为什么会有这样的结果。

实际上，在做qRT-PCR之前，我们第一个需要确定的是内参基因，根据自己实验材料和检测的基因选择好适合的内参基因后。开始为自己的片段设计引物。

与目的基因在内的所有引物Tm值不应相差两度。扩增片段的长度以200-300 bp为宜。除此之外，还需要注意以下法则：1）用于突变体的基因表达量鉴定时，引物最好设在两个外显子之间，横跨中间的内含子，这样可以避免DNA的污染；2）用于过表达基因表达量时，需找出该家族所有同源基因并进行比对，并在保守性最差的区域设计引物；3）用于标记基因检测的引物序列最好来自发表的文献。

最后值得注意的是，引物用完后需放入-20℃保存。尽量避免反复冻融，如果多次使用可在第一次溶解好后进行分装。如果在实验过程中出现以前能扩增的基因扩不出的现象，多半是引物降解或部分降解导致的。在实验期间引物解冻后需用涡旋混匀，离心待用。

最后附一些实用的qRT-PCR体系配置技巧：

1）一定要在冰上配置体系；

2）所有的枪头和PCR板都用进口的，灭菌的；

3）尽量用同一枪头完成样品分装，并且把控每次按压枪的位置标准；

4）模版加在管壁上，避免枪头离开时抽吸液体，最后离心。

肿瘤中激活的T细胞，控制肿瘤生长等，期待这些研究的临床试验数据和应用。