在众多依赖于活细胞将底物转化为生色产物的活力检测方法中,由Mossman
试剂
转染的哺乳动物细胞
DMSO
MTT 储备溶液
SDS-HCl 溶液
组织培养基
设备
96 孔板,标准平底
96 孔板, V 形底或圆底
能够读取多孔组织培养板的分光光度计
方法
标记细胞
1. 对于贴壁细胞, 除去培养基, 更换为l00μL 新鲜培养基。对于非贴壁细胞,离心微孔板使细胞沉淀,小心地尽可能除去培养基,更换为l00μL 新鲜培养基。
细胞培养基中的酚红指示剂会干扰MTT 反应。可能需要在无指示剂的培养基中培养细胞,或者在加入MTT 试剂之前更换为无指示剂的培养基。
2 . 向每孔加入l0μL 12mmol/L MTT 储备溶液。再做一个单独的l00μL 培养基中加入l0μLMTT 储备溶液的阴性对照。
3. 将培养板于37°C 孵育4h 。细胞密度较高时( 每孔大于100000 细胞) , 孵育时间可缩短至2h 。用SDS-HCl 或DMSO 溶解产生的甲臜。
用SDS-HCl 溶解甲臜
4. 向每孔加入l00μL SDS -HCl 溶液,用吸管彻底混匀,产生的甲臜被溶解。
5. 将微孔板于37°C 湿润温箱中孵育4 ~ 18h , 时间的长短取决于形成的甲臜产物的多少。孵育时间过长会降低检测的灵敏度。
6. 用吸管再次混匀每个样品,于570nm 处读取吸光度。
用DMSO 溶解甲臜
DMSO 是一种比SDS-HCl 更迅速、更常用的溶解试剂。
7 . 从孔中吸出培养基,仅余25μL 。
对于非贴壁细胞, 可能需要首先离心培养板以沉淀细胞。
8 . 向每孔加入50μL DMSO , 用吸管彻底混匀。
9 . 将培养板于37°C 孵育lOmin 。
10 . 再次混匀每个样品, 于540nm 处读取吸光度。