反转录定量PCR 分析小RNA

Northern 杂交可以揭示小RNA 的表达水平，同时也可揭示小RNA 的长度，并且是小RNA 验证和定量的标准。然而， Northern 杂交不能用来检测低丰度小RNA, 也不能检测大量的小RNA 种类。相比之下，定量RT-PCR 更加敏感并且可以适用于高通量处理（图1) 。

试剂

mirVana miRNA 提取试剂盒或TRizol 试剂
无核酸酶水
RNA 样品，总RNA 对照和内源性RNA 对照（如TaqMan 小RNA 对照）
TaqMan microRNA 反转录试剂盒
TaqMan 小RNA 检测试剂盒
TaqMan Universal PCR Master Mix II , 不含uracil N-glycosylase ( UNG )
TE 缓冲液( pH 8.0, 10 X 和0.1 X)

设备

带微孔板转头的离心机
加热模块
PCR 板( 96 孔）
PCR 管
实时PCR 热循环仪

方法

RNA 样品制备

1 根据使用说明书，用mirVana miRNA 提取试剂盒或TRizol 试剂提取总RNA, 并将总RNA 溶于水中。
2 运用分光光度计测量RNA 浓度和纯度。
3 根据TaqMan Small RNA Assays设计工具设计TaqMan 小RNA 检测序列。

反转录

4 将TaqMan MicroRNA 反转录试剂盒中的试剂置冰上溶解，用0.1 X TE 缓冲液把RT引物稀释成5X 工作液浓度。
5 在1.5mL 试管中加入以下试剂，在冰上将其混合制成RT 混合液。

6 轻轻涡旋振荡， 离心1 ~ 2s 收集试管底部的反应物。
7 每15μL 的RT 反应液中，取出12μL 含总RNA （步骤5) 的RT 混合液加入到96孔板的各个孔中。
8 向含RT 混合液的96 孔板的各个孔中加入3μL 的5XRT 引物。
9 盖上96 孔板， 离心1 ~ 2s 收集底部反应物。
10 将96 孔板冰上静置5min, 然后置于热循环仪中。根据以下程序进行反转录：

i. 16 ℃ 30min
ii. 42℃ 30min
iii. 85℃ 5min
iv. 4 ℃ 保存
V. 结束

11 若不立即进行PCR 扩增， 需将RT 反应液置于－20 ℃ 储存，或者立即进行PCR 扩增。

qPCR 扩增

每个反应设置3 个平行试验组， 且每块板中需包含：每个cDNA 样品中的小RNA 含量检测组， 内参检测组，用来检测背景信号的无模板对照组。

12 冰上溶解TaqMan Assay (20 X ) 。冰上准备定量PCR 混合液，在1.5mL 的离心管中加入以下试剂：
每个样品的3 个平行组所用试剂体积如下，并配制10％的富余以弥补混合过程中的损失。

TaqMan 小RNA 检测试剂( 20 X)	3.3μL
RT 反应产物	4.4 μL
TaqMan Universal PCR Master Mix ll ( 2X)	3.3μL
无核酸酶水	25.3μL
总体积	66μL

13 反复颠倒试管数次至混匀，离心1 ~ 2s 收集试管底部反应物。
14 96 孔板中，向3 个平行试验组的各个孔中加入20μL 定量PCR 反应混合液。
15 盖上96 孔板，离心1~2s 收集底部反应物。
16 将96 孔板置于实时PCR 热循环仪上，运行以下程序进行cDNA 扩增：
i. 95 °C 10min
ii. 95 °C 15s
iii. 60 °C 60s
iv. 运行步骤16 中 ii 和iii, 重复39 个循环以上
V. 4 °C 保存
vi. 结束

数据分析

17 根据实验设计，可运用不同统计方法对小RNA 的表达情况进行分析。例如，相对标准曲线、相对CT 、DART-PCR 或S 形曲线拟合法(SCF) 等。