Trizol法提取总RNA的原理及注意事项

原理：Trizol试剂是直接从细胞或组织中提取总RNA的试剂。在样品裂解或匀浆过程中，Trizol能保持RNA的完整性。加入氯仿后离心，样品分成水样层和有机层。RNA存在于水样层中。收集上面的水样层后，RNA可以通过异丙醇沉淀来还原。在除去水样层后，样品中的DNA和蛋白也能相继以沉淀的形式还原。乙醇沉淀能析出中间层的DNA，在有机层中加入异丙醇能析出有机层的蛋白。共纯化DNA对于样品间标准化RNA的产量十分有用。

Trizol试剂可用于小量样品（50~100mg组织，5×10⁶细胞），也可用于大量样品（≥1g组织或≥10⁷细胞），对人、动物、植物和细菌、血液提取都适用，可同时处理大量不同样品。一个小时内即可完成反应，提取的总RNA没有DNA和蛋白质污染，可用于Northern blot、RT-PCR、Dot blot、RNase保护分析等。

本试剂为红颜色，便于区分水相和有机相，同时最大限度的保持RNA的完整性。

保存条件：2~8℃避光保存12个月。

实验前需要准备的试剂：

Trizol，氯仿，异丙醇，75%乙醇（用RNase-Free水配制），RNase-Free水。

实验前需要准备的物品：

1ml注射器，1.5ml EP管（DEPC处理过），大、中、小号枪头（DEPC处理）

样品前处理注意点：

• 选择新鲜血液，不得超过4小时。
• 选择新鲜组织，生长旺盛的组织。
• 选择新鲜的幼嫩组织。
• 选择处于生长旺盛的时期收集细胞。

RNA纯化要求：

• 纯化后不应存在对酶（如逆转录酶）有抑制作用的物质。
• 排除有机溶剂和金属离子的污染。
• 蛋白质、多糖和脂类分子等的污染降到最低程度。
• 排除DNA分子的污染。

RNA提取的注意事项：

• 杜绝外源酶的污染。
• 严格戴好口罩，手套。
• 实验所涉及的离心管，Tip头，移液器杆，电泳槽，实验台面等要彻底处理。
• 实验所涉及的试剂/溶液，尤其是水，必须确保RNase-Free。
• 阻止内源酶的活性。
• 选择合适的匀浆方法。
• 选择合适的裂解液。
• 控制好样品的起始量。
• 明确自己的提取目的。
• 任何裂解液系统在接近样品最大起始量时，提取成功率急剧下降。
• RNA提取成功的唯一经济的标准是后续实验的一次成功，而不是得率。

Rnase污染的10大来源

• 手指头
• 枪头
• 水/缓冲液
• 实验台面
• 内源Rnase
• RNA样品
• 质粒提取
• RNA保存
• 阳离子（Ca，Mg）
• 后续实验所用的酶