siRNA表达载体的构建

siRNA表达载体构建可以：（1）作为后基因组时代基因功能分析的有力工具；（2）应用于基因组学、细胞信号传导通路分析；（3）用于药物靶点筛选、疾病治疗。

实验方法原理:

多数的siRNA表达载体依赖三种RNA聚合酶III 启动子(pol III)中的一种，操纵一段小的发夹RNA(short hairpinRNA, shRNA)在哺乳动物细胞中的表达。这三类启动子包括大家熟悉的人源和鼠源的U6启动子和人H1启动子。之所以采用RNA pol III启动子，是由于它可以在哺乳动物细胞中表达更多的小分子RNA，而且它是通过添加一串（3到6个）U来终止转录的。要使用这类载体，需要订购2段编码短发夹RNA序列的DNA单链，退火，克隆到相应载体的pol III 启动子下游。由于涉及到克隆 ，这个过程需要几周甚至数月的时间，同时也需要经过测序以保证克隆的序列是正确的。

实验材料:

目的基因

试剂、试剂盒：

LB培养基

仪器、耗材：

离心管、离心机、水浴锅、漩涡振荡仪等

实验步骤：

一、目的基因的确定

1. 检索文献获取有实验证明有效的靶点序列（核对）。
2. NCBI查阅：http://www.ncbi.nlm.nih.gov/。
3. 搜索引擎辅助：http://www.google.cn/ or http://scholar.google.com。

二 、设计siRNA靶序列

在制备siRNA 前都需要单独设计siRNA序列。研究发现对哺乳动物细胞最有效的siRNAs是21-23个碱基大小，3’端有两个突出碱基的双链RNA；而对非哺乳动物，比较有效的是长片段dsRNA。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。

1. 选择siRNA靶位点

从转录AUG起始密码子开始，搜寻下游AA序列，记录跟每个AA 3’端相邻的19个核苷酸作为候选的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%-50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions,UTRs），原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2. 序列同源性分析

将潜在的序列和相应的基因组数据库（人或者小鼠、大鼠等等）进行比较,排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）选出合适的目标序列进行合成.并非所有符合条件的siRNA都一样有效,其原因还不清楚，可能是位置效应的结果,因此对于一个目的基因，一般要选择3-5个靶位点来设计siRNA。

通常来说，每个目标序列设计3-4对siRNAs，选择最有效的进行后续研究。

3. 设计阴性对照

一个完整的siRNA实验应该有阴性对照，作为阴性对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA中的碱基序列打乱。当然，同样要保证它和其他基因没有同源性。

三、表达载体的选用

1. 化学合成与体外转录方法都是在体外得到siRNA后再导入细胞内，但是这两种方法主要有两方面无法克服的缺点：siRNA进入细胞后容易被降解；进入细胞siRNA在细胞内的RNAi效应持续时间短.针对这种情况，出现了质粒、病毒类载体介导的siRNA体内表达。该方法的基本思路是：将siRNA对应的DNA双链模板序列克隆入载体的RNA聚合酶III的启动子后，这样就能在体内表达所需的siRNA分子。这种方法总体的优点在于不需要直接操作RNA，能达到较长时间的基因沉默效果。
2. 通过质粒表达siRNAs大都是用Pol III启动子启动编码shRNA(small hairpin RNA)的序列。选用Pol III启动子的原因在于这个启动子总是在离启动子一个固定距离的位置开始转录合成RNA，遇到4—5个连续的U即终止，非常精确。当这种带有Pol III 启动子和shRNA模板序列的质粒转染哺乳动物细胞时，这种能表达siRNA的质粒确实能够下调特定基因的表达，可抑制外源基因和内源基因。采用质粒的优点在于，通过siRNA表达质粒的选择标记，siRNA载体能够更长时间地抑制目的基因表达。当然还有一点，那就是由于质粒可以复制扩增，相比起其它合成方法来说，这就能够显著降低制备siRNA的成本。
3. 带有抗生素标记的siRNA表达载体可用于长期抑制研究，通过抗性辅助筛选，该质粒可以在细胞中持续抑制靶基因的表达数星期甚至更久。同时RNAi-Ready表达载体还能与逆转录病毒和腺病毒表达系统整合（BD Knockout RNAi Systems），大大提高siRNA表达载体对宿主细胞的侵染性,彻底克服某些细胞转染效率低的障碍，是实现哺乳动物细胞siRNAs瞬时表达与稳定表 达的理想工具。

四、合成模板

1. 合成编码 shRNA的DNA 模板的两条单链，模板链后面接有RNA PolyIII聚合酶转录中止位点，同时两端分别设计 BamH I 和 Hind III 酶切位点，可以克隆到 siRNA 载体多克隆位点的 BamH I 和 Hind III 酶切位点之间。
2. 95℃，5 min，缓慢退火， DNA 单链得到 shRNA 的 DNA 双链模板。

五、连接与转化

1. 将100 μl感受态细胞于冰上解冻。
2. 取5 μl连接产物加入到感受态细胞中，轻轻旋转几次以混匀内容物，在冰上放置30分钟。
3. 将管放入预加温到42℃的水浴中，热激90秒。快速将管转移到冰浴中，使细胞冷却1~2分钟。
4. 每管中加700 μl LB培养基，37℃振荡培养1小时，进行复苏。
5. 室温4 000 rpm离心5分钟，弃去上清后，用剩余100 μl培养基重悬细胞并涂布到含抗性的LB琼脂平板表面.注意：细胞用量应根据连接效率和感受态细胞的效率进行调整。
6. 将平板置于室温直至液体被吸收。
7. 倒置平皿，于37℃培养，12~16小时后可出现菌落。

六、PCR鉴定和测序鉴定

在插入编码shRNA的DNA双链模板两侧设计鉴定PCR引物，扩增片段在100-200bp之间。

注意事项：

1. 从转录本（mRNA）的AUG起始密码开始，寻找“AA”二连序列，并记下其3’端的19个碱基序列，作为潜在的siRNA靶位点。有研究结果显示GC含量在30%—50%左右的siRNA要比那些GC含量偏高的更为有效。

Tuschl等建议在设计siRNA时不要针对5’和3’端的非编码区（untranslated regions，UTRs)，原因是这些地方有丰富的调控蛋白结合区域，而这些UTR结合蛋白或者翻译起始复合物可能会影响siRNP核酸内切酶复合物结合mRNA从而影响siRNA的效果。

2. 将潜在的序列和相应的基因组数据库（人，或者小鼠，大鼠等等）进行比较，排除那些和其他编码序列/EST同源的序列。例如使用BLAST（ www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/）
3. 选出合适的目标序列进行合成。通常一个基因需要设计多个靶序列的siRNA，以找到最有效的siRNA序列。
4. 一个完整的siRNA实验应该有负对照，作为负对照的siRNA应该和选中的siRNA序列有相同的组成，但是和mRNA没有明显的同源性。通常的做法是将选中的siRNA序列打乱，同样要检查结果以保证它和其他基因没有同源性。

如果计划合成siRNA，那么可以直接提供以AA打头的21个碱基序列，厂家会合成一对互补的序列。注意的是通常合成的siRNA是以3’dTdT结尾，如果要UU结尾的话通常要特别说明。有结果显示，UU结尾和dTdT结尾的siRNA在效果上没有区别。因为这个突出端无需和靶序列互补。