英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
该实验方案是从少量( l ~ 2mL ) 细菌培养物中分离质粒DNA 。DNA 产量为l00ng~ 5μg ， 这取决于质粒的拷贝数。少量的DNA 作为体外酶促反应的底物或者模板是足够的，但是，如果质粒DNA 用于测序则需要进一步纯化。
很多年以来， 碱裂解法提取质粒DNA 一直是标准的方法。如今，人们更倾向于用试剂盒提取。下列方案是早期实验的回顾。
材料
碱裂解液I<A> ，冰浴
碱裂解液II<A> 破裂解液II 应新鲜制备， 于室温下使用。
碱裂解液III<A> ，冰浴
用于筛选质粒的抗生素
精氨酸缓冲液( 0. lmol/L , pH 12.4 ) （可选；见步骤5 )
配制该溶液，可用p H12.4 的5mol/L NaOH 调整O. lmol/L L－精氨酸溶液的pH 。
转化了所需质粒的细菌克隆
乙醇( 70% , 90%)
酚：氯仿（1:1, VIV) （可选；见步骤8 )
培养基( LB 、YT 或者Terrific Broth ) <A>
STE<A> ，冰浴（可选， 见步骤3 )
Tris-EDTA(TE)(pH 8.0) <A> 含20μg/mL RNase A
设备
细菌摇床， 3 7 °C
KimWipes纸巾
巴斯德吸管和吸球（可选； 见步骤3 )
携带式真空吸气器（可选； 见步骤3 和13 )
方法
细胞的制备
- 挑转化后的单克隆菌落，接种到2mL 含有适当抗生素的培养中( LB 、YT 或者Terrific Broth ) ，于37 °C 剧烈振荡过夜。
为确保培养物通气良好：
- 试管的体积应该至少比细菌培养物的体积大4 倍。
- 试管盖要盖得松些。
- 培养物要在剧烈振荡下过夜培养。
- 将l.5mL 培养物倒入微量离心管，用微量离心机在4℃ 以最大转速离心30s, 将剩余培养物储存在4℃ 。
- 离心完成后， 尽最大可能吸干培养液。
细胞的裂解
- 用l00μL 预冷的碱裂解液Ⅰ 重悬细菌沉淀，剧烈振荡。
- 加入200μL 新鲜配制的碱裂解液II 于每管细菌悬液中， 盖紧管口，快速颠倒离心管5 次，以混合内容物， 切勿振荡！将离心管放置在冰上。
- 加入150μL 用冰预冷的碱裂解液Ⅲ, 盖紧管口，反复数次颠倒，使溶液Ⅲ在黏稠的细菌裂解物中分散均匀，之后将管置于冰上3 ~ 5mm 。
- 用小离心机于4℃ 以最大转速离心5min，将上清转移至另一离心管中。
- （ 可选） 加等量体积的酚：氯仿，振荡混合有机相和水相，然后用小离心机于4℃以最大转速离心2min 。将上清转移至另一离心管中。
质粒DNA 的回收
- 用2 倍体积的乙醇于室温沉淀核酸，振荡混合，于室温放置2min 。
- 用微量离心机于4 °C 以最大转速离心5mm ，收集沉淀的核酸。
- 吸去上清液，将离心管倒置在纸巾上，以使所有的液体排干，用KimWipes 纸巾或一次性吸头除去管壁上的液滴。
- 加1 mL 70％的乙醇于沉淀中并将盖紧的试管颠倒数次，用微量离心机在4℃ 以最大转速离心2min, 回收DNA 。
- 再次轻微抽吸除去所有上清。
- 除去管壁上的乙醇液滴，应将开口的试管置于室温挥发乙醇，直至试管内没有可见液体存在( 5 ~ 10min ) 。
- 用50μL 含有去DNA 酶的RNase A （胰RNA 酶） （ 20μg/mL) 的TE ( pH8 . 0 ) 重新溶解核酸，温和振荡几秒，储存于－2 0 °C 。