DEAE－葡聚糖介导的转染：提高细胞活力的方案

与之前文章中介绍的DEAE－葡聚糖方法相反，此替方案采用较低浓度的DEAE－葡聚糖$250\mu g/mL$ ，与细胞作用的时间较长（达8h) 。尽管不如使用高浓度DEAE－葡聚糖的转染效率高，但低水平的DEAE－葡聚糖细胞毒性小。

试剂

DMEM 培养基

HEPES 缓冲的DMEM 培养基

方法

1. 转染前24h, 通过胰酶消化收集指数生长的细胞，按10⁵ 个细胞／培养皿的密度接种于60mm 组织培养皿（或5 X 10⁴ 个细胞／35mm 培养皿）。加入5mL （35mm 培养皿为3mL )完全培养基，于含5%~ 7%C0₂ 的37°C 湿润保温箱中培养20~ 24h 。

2. 于lmL HEPES 缓冲的DMEM 中混合O.l ~ lμg 超螺旋或环状质粒DNA 和250μg DEAE－葡聚糖。得到的溶液每60mm 培养皿用量为500μL, 每3 5mm 培养皿用量为2 50μL 。
3. 吸出细胞培养皿中的培养基，用预热$37°C$ 的HEPES 缓冲的DMEM 洗涤细胞两次。
4. 加入DNA/DEAE－葡聚糖/DMEM 溶液( 500μL/60mm 培养皿， 250μL/35mm 培养皿），将细胞放回保温箱培养8h 。每2h 轻摇培养皿，以保证细胞均匀接触DNA/DEAE－葡聚糖/DMEM 溶液。

同时用二磷酸氯喹处理细胞可使转染效率增加数倍。如果使用氯喹，则应先将其加入DNNDEAE－葡聚糖溶液中（终浓度I00μmo l/L ），然后再将溶液加入细胞中。氯喹对细胞有毒性，此时孵育时间应限制在3 ~ 5h 。

据报道， 对该步骤做一简单变动可使COS 细胞的转染效率加倍$GonzalesandJoly1995$ : 在实验开始时用带螺旋盖的小细胞瓶培养细胞，在步骤4 中加入DNNDEAE－葡聚糖/DMEM 溶液后旋紧瓶盖。继续培养8 h , 此期间由于细胞瓶中残留的少量CO₂ 被代谢掉，培养基缓慢变碱。培养基中酚红指示剂的颜色明显地从绯红逐渐加深至紫红色，这种变化可能会促进转染，与减少保温箱内CO₂ 浓度的效果类似

5 . 吸出DNA/DEAE－葡聚糖/DMEM 溶液，用预热$37°C$ 的、HEPES 缓冲的DMEM温和洗涤细胞两次。注意不要吸出转染细胞。

6 . 用预热的含血清DMEM $NaHC03\mathrm{缓}\mathrm{冲}，\mathrm{无}HEPES$ 洗涤细胞一次。向细胞中加入5mL （每60mm 培养皿）或3mL （每3 5mm 培养皿）完全培养基， 置于含5%~ 7 % CO₂ 的37°C 湿润保温箱中培养36 ~ 60h, 然后分析转染DNA 的瞬时表达。

7. 为分析转染细胞中导入DNA 的瞬时表达情况，在转染后36 ~60h 收获细胞。通过杂交分析RNA 或DNA ； 通过体内代谢标记进行放射性免疫测定、免疫印迹、免疫沉淀，或者通过检测细胞抽提物的酶活性分析新合成的蛋白质。