Crispr/Cas9腺病毒构建流程

Crispr/Cas9 简介

CRISPR (clustered, regularly interspaced, short palindromic repeats)是一种来自细菌降解入侵的病毒 DNA 或其他外源 DNA 的免疫机制。目前，来自Streptococcus pyogenes 的CRISPR-Cas9系统应用最为广泛。Cas9 蛋白（含有两个核酸酶结构域，可以分别切割DNA 两条单链。Cas9首先与crRNA及tracrRNA结合成复合物，然后通过PAM序列结合并侵入DNA，形成RNA-DNA复合结构，进而对目的DNA双链进行切割，使DNA双链断裂。

CRISPR-Cas9系统已经成功应用于植物、细菌、酵母、鱼类及哺乳动物细胞，是目前最高效的基因组编辑系统。

通过基因工程手段对crRNA和tracrRNA进行改造，将其连接在一起得到sgRNA（single guide RNA）。融合的RNA具有与野生型RNA类似的活力，但因为结构得到了简化更方便研究者使用。通过将表达sgRNA的原件与表达Cas9的原件相连接，得到可以同时表达两者的质粒，将其转染细胞，便能够对目的基因进行操作。

Crispr/Cas9腺病毒特点：

1、可感染多种分裂期和非分裂期细胞，感染效率高、敲除效率高；

2、操作简单，容易掌握；

3、基因敲除周期短，成本低；

4、适合哺乳动物不同种属不同基因的操作，适用范围广。

Crispr/Cas9腺病毒流程

gRNA设计及双链合成→Ad-SpCas9载体构建及测序→Ad包装质粒共转染293A细胞→腺病毒小量出毒及大量扩增→腺病毒病毒浓缩及纯化→腺病毒滴度测定