通过转染双链siRNA 在哺乳动物细胞中进行RNA 干扰

长链dsRNA 不能用于多数哺乳动物细胞中，这是由于它能诱导干扰素反应而引发基因表达和细胞凋亡的变化。本方案介绍了一种向哺乳动物细胞中转入短的双链siRNA 的方法，双链siRNA 因其长度过短而不能引起与dsRNA 相关的序列非特异性反应。本方案适用于24 孔板中生长的细胞。如果使用了其他规格的多孔板、培养瓶或者培养皿，则需要根据培养孔的表面积换算细胞密度和试剂用量（表1 ) 。

表1 哺乳动物细胞转染所用的细胞、DharmaFEC T4 转染试剂和siRNA （或者ASO) 体积

培养板或皿	24 孔	12 孔	6 孔	6cm	10cm
每孔表面积/cm2	2	4	10	20	60
DMEM+10%FBS/mL	0.45	0.9	1.8	4.5	9
A 管 DMEM/μL 10μmol/L 双链siRNA 或12.5μmol/LASO/μL	24 1	48 2	96 4	240 10	480 20
B 管 DMEM/μL DharmaFECT4 转染试剂／μL	24 1	48 2	96 4	240 10	480 20
总体积/mL	0.5	1	2	5	10

试剂

转染试剂
Dulbecco’s 改良Eagle’s 培养基( DMEM)
Dulbecco’s 磷酸盐缓冲液( PBS ) ，不含钙和镁
热灭活的胎牛血清( FBS )
哺乳动物细胞系（ 如HeLa 或者NTera2 )
青霉素和链霉素
双链siRNA (10μmol/L )
胰蛋白酶EDTA 溶液

设备

离心机
锥形离心管(50mL)
免疫荧光、Western 印迹、定量RT-PCR 或者Northern 杂交用设备（步骤10)
层流生物安全柜( II 级）
微量离心管( 1 .5mL )
体视显微镜
组织培养皿(10cm)
组织培养箱(37’C, 5% CO²) , 一定湿度
组织培养板( 24 孔）

方法

准备转染用细胞
1. 细胞在DMEM 培养基（含有10％胎牛血清、100U/mL 青霉素以及100μg/mL 链霉素）中培养， 37℃、5%CO² 生长至90％单层。
2. 使用胰蛋白酶－EDTA 溶液消化细胞使其脱离培养板，然后将细胞重悬于无抗生素、含有10％胎牛血清的DMEM 培养基中。24 孔板每孔接种此细胞悬液500μL 。
3. 将细胞在37 °C 、5% CO² 培养箱中孵育过夜，使其达到转染时所需的30%~ 40％单层（约每孔5 X10⁴ 个细胞）。

准备转染溶液

所有的体积都是以单孔实验计算。但是，建议至少进行3 次平行重复实验。进行多孔转染时，额外增加10％的试剂以避免在分装时造成损失。

4. 向一个装有24μL DMEM 培养基（无抗生素和血清）的微量离心管中加入lμL（10pmol) 双链siRNA, 轻轻颠倒混匀。
5. 向另一个装有24μL DMEM 培养基（无抗生素和血清） 的微量离心管中加入lμL DharmaFECT 4 转染试剂，轻轻颠倒混匀。
6. 将两种混合液在室温下孵育5min 。将siRNA 混合液缓慢加入DharmaFECT 4 转染试剂混合液中，轻轻颠倒混匀，室温下静置20min, 使之形成siRNA－脂质体复合物。

转染和基因敲减分析

7. 将细胞培养液（步骤3) 更换为450μL 无抗生素、含10％胎牛血清的DMEM （预先平衡温度至37°C) 。
8 将50μL siRNA－脂质体转染培养液（步骤6) 加入每个孔内。努力将液体均匀加入孔内，加完后轻轻晃动混匀。
9. 将细胞置于37 °C 、5% CO² 培养箱中培养。
10. 对基因敲减( knock down) 效果的分析：通过免疫荧光和Western 印迹法， 利用特异性识别目标蛋白的抗体检测目标蛋白的表达水平，通过定量RT-PCR 或者Northern 杂交检测目标mRNA的减少量。

问题分析

问题（步骤10) ： 没有检测到基因敲减。

解决方案： 这可能是由于转染效率不高，或者siRNA 降解。可以通过以下方法解决。

• 重新转染带有荧光标记的双链siRNA 。
• 使用其他转染效率更高的转染试剂或siRNA 。例如RNA转染试剂Entranster^TM-R
• 利用非变性聚丙烯酰胺凝胶检查双链siRNA 。
• 如果发生降解， 重新制备双链siRNA 并重复全部实验。

问题（步骤10) ： 发现siRNA 作用没有预想的好。

解决方案： 本方案中使用的双链siRNA 的浓度是20nmol/L 。在1 ~ 100nmol/L 优化双链siRNA 的浓度。
靶向同一基因的不同siRNA 的沉默效率会不同。应该针对既定mRNA 的几条不同双链siRNA 进行比较。