视神经星状胶质细胞的培养

随着细胞培养技术的不断改进，虽然正常细胞难于培养成活，科研人员还是不断研究各种正常细胞的培养方法。到目前为止，几乎体内各种组织细胞均可在体外成功培养。越来越多的研究工作可应用体外培养的正常细胞作为模型开展工作。神经胶质细胞的成功培养最早由Raff 等完成。视神经胶质细胞的培养开始于1990 年，先后有多个实验室培养成功。视神经胶质细胞参与眼部多种疾病的发生、发展。视神经胶质细胞可在体外传代培养， 并具备相应功能。该细胞可用于其生物学的基础研究、临床研究，并可作为探讨视神经发病机制、治疗措施的基础，也可作为表达神经胶质细胞特异蛋白、因子等生物制品的工具。视神经周围的星状胶质细胞，在眼部多种疾病发生中，均有重要作用。利用体外培养的视神经星状胶质细胞在研究药物作用机制及将来筛选新药中有重要意义。

（一）材料与设备

1. 材料4~7d 的新生Wistar 大鼠。
2. 试剂培养液、胎牛血清、0.25％胰蛋白酶／0.04％胶原酶、消化液、100μg/ml 的多聚赖氨酸、0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 消化液。
3. 设备培养皿、移液器、枪头、盖玻片、细胞计数板、离心管、超净工作台、CO₂ 培养箱、倒置显微镜、离心机、解剖显微镜。

（二）试剂配制

1. L– 多聚赖氨酸(0.1mg/ml)    用于包被培养皿。取L－多聚赖氨酸10mg 加到100ml 0.01mol/L PBS (pH 7.4) 中溶解并用0.22μm 的微孔滤器除菌。
2. 0.05％胰蛋白酶／0.02%EDTA 消化液
(1) 取0.5g 胰蛋白酶置玛瑙研钵中，先放入少量D-Hanks 溶液研磨20min 以上，之后再溶于450ml D-Hanks 溶液中。
(2) 在450ml D-Hanks 溶液中加入0.2g EDTA （乙二胺四乙酸）在磁力搅拌器上剧烈搅拌，用NaOH 调节溶液的pH 至8.0, 于37°C 水浴中溶解。
(3) 将（1）、（2）混合，用D-Hanks 溶液定容至1L (pH 8.0) ，并用0.22μm的微孔滤器过滤除菌分装，－20℃ 保存备用。
注意，须加入NaOH 将溶液的pH 调至接近8.0 时， EDTA 才能完全溶解。
3. 0.25％胰蛋白酶消化液   取0.25g 胰蛋白酶在玛瑙研钵中先放少量D-Hanks 溶液研磨20min 以上，之后再用D-Hanks 溶液定容至100ml ，并用0.22μm的微孔滤器过滤除菌。
4. 0.04％胶原酶消化液取40mg 的胶原酶溶于100ml D-Hanks 溶液中，并用0.22μm 的微孔滤器过滤除菌。

（三）操作步骤

1 ．细胞的分离培养。在解剖显微镜下分离视神经管到视交叉后1 ~2mm, 切除视神经。
2. 用MEM-EBSS 含HEPES (0.02mol/L) 液洗2~3 次，置于无菌培养皿中剪碎。
3. 先用等容积的0.25％胰蛋白酶和终浓度为0.02％的胶原酶37°C 消化15min，以每分钟1 000 转的速率离心10min, 重复2 次。
4. 再用0.05％胰蛋白酶/0.02%EDTA 消化液37°C 静置消化15min, 取出摇晃一下再继续消化15min, 以每分钟1 000 转的速率离心10min, 弃去上清液。
5. 加入含1.7％牛血清白蛋白、10％胎牛血清的DMEM 培养液通过21G 针头(0.8mm) 6~7 次。过筛网，细胞悬液用含20％胎牛血清的DMEM 培养液终止消化。以每分钟1 000 转的速率离心5min, 收集细胞。
6. 用含20％胎牛血消 、青霉素(100U/ml) 、链霉素(100μg/ml）DEME 培养液重新悬浮细胞，分别移入用100μg/ml 的多聚赖氨酸或2％明胶包被过的培养皿中。
7. 置7% CO₂ 培养箱内，在37°C 条件下培养，根据细胞贴壁情况， 1 周后换液。待细胞接近汇合，用常规消化方法以 1: 2 方式传代。

（四）细胞鉴定

神经胶质纤维酸性蛋白(glial fibrillar acid protein, GFAP) 细胞免疫组化鉴定，显示星状细胞胞质内有棕色阳性产物， 细胞核不着色， 核膜清晰

（五）注意事项

1. 用L－ 多聚赖氨酸( 0.1mg/ml ) 包被培养板后， 要待其干后先用D-Hanks溶液漂洗2 次再接种， 因为其对细胞有毒性。L－多聚赖氨酸( 0.1mg/ml ) 能回收再利用。
2 . 其他  幼鼠比成年鼠更易成功。