肿瘤细胞的原代培养

由于不同人种、不同民族的遗传基因不同，所以对不同疾病， 特别是对复杂疾病的易感性、对各种药物的耐受性和对各种环境因子的反应也不同，建立国人肿瘤细胞株， 可为国人疾病的诊断、防治及药物开发提供肿瘤模型。

（一）材料与设备

1. 无菌材料眼科剪，眼科镂， 一次性培养皿，细胞培养瓶T25 、T75 , 冻存管，一次性小滤器， 一次性离心15~50ml， 高糖DMEM 培养液， 1% 1V型胶原酶，青／链霉素，胎牛血清，二甲基亚砜，冻存液。
2. 设备超净操作柜／台、CO₂ 培养箱、4 ℃ 冰箱、－70°C 冰箱、离心机、相差显缴镜及照相设备。

（二）操作步骤

无菌条件下，取肿瘤手术切除的肿瘤组织，置于50ml 含双倍双抗试液D-Hanks溶液的离心管中，并尽快运输到实验室，尽快进行以下操作。
1． 在超净操作台中，将肿瘤组织从离心管中移出，在10cm 的培养皿内，将脂肪、出血部分剔除，将肿瘤组织块用D-Hanks 溶液（含双倍的双抗试液）清洗干净，将组织移入另一无菌培养皿内。
2. 用无菌剪刀将组织剪碎至2~3 mm³ 大小，用D-Hanks 溶液将剪好的组织块清洗2 次，然后将组织块移入15ml 离心管中，经350g 离心8min 后，弃去上清液，加3ml IV型胶原酶混匀， 37°C 水浴15min, 每5min 震荡1 次。
3. 当酶液变混浊时（在显微镜下可见大量游离细胞） ，轻吸上清液移入另一无菌离心管并加入含血清的高糖DMEM培养液终止反应。
4 . 未消化完的组织块再加入新鲜消化液，重复此步骤2~3 次，直至大部分细胞被消化下来，消化好的细胞悬液混匀，经350g 离心8min, 弃去上清液，并用D-Hanks 溶液洗涤2 次。
5. 将细胞溶解于8ml 高糖DMEM 完全培养液中，接种于T25 细胞培养瓶中。
6. 细胞培养在37°C 、5% CO₂ 培养箱中， 48h 后换液，弃掉未贴壁细胞。每2~3d 换液1 次，待细胞长满后传代培养。
7. 在细胞扩增到不同代数时，可将部分细胞的进行冻存。一方面尽早保存一些细胞，便于日后对比观察、鉴定，另一方面可做些储备，以防微生物污染或发生细胞交叉污染。

（三）细胞形态学鉴定

将细胞接种在直径10cm 培养皿中的盖玻片上至细胞汇合（放入5% CO₂ 、95% 湿度的培养箱中培养），根据需要作CK、HE 等染色。

（四）试剂的配制

1. 抗生素的配制   青霉素和链霉素， 一般配制浓度均10000U/ml 和10000μg/ml，用无菌的D-Hanks 溶液或生理盐水溶解，分装小瓶， 5ml/瓶， －20℃ 冰箱保存备用。用时每100ml 完全培养液加1ml双抗试液（每毫升培养液含宵霉素100U/链霉素100μg ）。
2. 完全培养液的配制   高糖DMEM 培养液＋ 10％胎牛血清＋1％双抗试液。
3. 冻存液的配制   30％的胎牛血清， 5％的二甲基亚砜，分装， －20℃冰箱保存备用。使用时1ml 可冻存一管。

（五）小结

1. 做好详细的实验记录。
2. 注意无菌操作并防止细胞间的交叉污染。
3. 细胞每传7~8 代冻存1 批，并记录清楚代数。
4. 20 次以后，进行全面鉴定。