磷酸钙转染法实验原理及步骤

【实 验 原 理】

磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法。磷酸钙有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以在细胞内进行瞬时表达，也可整合到靶细胞的染色体上从而产生不同基因型和表型的稳定克隆。该方法可广泛用于转染许多不同类型的细胞。

【仪器、材料和试剂】
（一）仪器、用具
CO₂培养箱、10cm细胞培养平板、巴斯德吸管、微量移液器、15ml锥形管、烧杯、量筒等。
（二）材料
呈指数生长的真核细胞BALB/c 3T3
CsCl纯化的表达质粒DNA
（三）试剂
1．完全培养液
DMEM 90ml
FCS 10ml
2．2M CaCl₂，过滤除菌，-20℃保存备用
3．2×HEBS (g/500ml)
NaCl 8.0
KCl 0.38
Na2HPO₄.7H2O 0.19
HEPES 5.0
葡萄糖 1.0
用NaOH调pH至6.95，过滤除菌后，-20℃保存备用。

【方法与步骤】
1．在10cm的培养板上接种接种1×10⁶个BALB/c 3T3细胞
第二天进行转染
2．准备CaPO₄沉淀
2.1 准备两组试管
在A管中加入： 15μg质粒DNA
69μl 2M CaCl₂
460μl重蒸水
在B管中加入： 550μl 2×HEBS
2.2 用巴斯德吸管将A管中的溶液缓慢地逐滴加入在B管中，同时用另一吸管吹打B管溶液，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。
2.3室温静置30min，出现细小颗粒沉淀。
3. 小心地将沉淀逐滴均匀地加入培养细胞的10cm平板中，轻轻晃动（此过程需尽快完成）。
4. 在5%CO2的加湿培养箱中培养细胞2-6 hr。
5. 除去培养液，加入10ml完全培养液培养细胞1-6天（依具体情况而定）。
6. 收集细胞进行基因活性的检测，或分散接种到其他培养皿中进行选择培养。

【注 意 事 项】
1．在整个转染过程中要保持无菌操作。
2．在实验中使用的各种试剂都必须小心校准，保证质量。
3．质粒DNA 需CsCl纯化，乙醇沉淀后的DNA应保持无菌，在无菌水或Tris- EDTA中溶解。
4．沉淀物的大小和质量对于磷酸钙转染的成功至关重要。在磷酸盐溶液中加入DNA-CaCl₂ 溶液时需用空气吹打，以确保形成尽可能细小的沉淀物，因为成团的DNA不能有效地黏附和进入细胞。