英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
pShuttle 质粒被用来将携带的目的基因转移到腺病毒载体骨架中。步骤1 ~9 阐述了将目的基因克隆到有双筛选系统的pSh-pkGFP 质粒中。目前在使用的pShuttle 或pSh-pkGFP 中包含一个CMV 启动子驱动的表达盒，，可以用来克隆外源基因或替换启动子。
1. 在无菌的05mL 离心管中将外源基因载体和pSh-pkGFP 载体分别用以下条件消化：
| DNA | 1~2μg |
| 限制性内切核酸酶A | 0.5μL |
| 限制性内切核酸酶B | 0.5μL |
| 限制性内切核酸酶缓冲液（10X） | 2.0μL |
加水至总体积达2 0μL ， 混匀， 37 °C 水浴lh 。
2. 取2μL 消化产物在1 ％低融点琼脂糖凝胶中电泳，分析确认条带与质粒图谱一致。
3. 按照说明书用小牛肠碱性磷酸酶去磷酸化pShuttle 骨架。
4. 将余下18μL 消化产物通过1%LMA 凝胶电泳分离条带，将含有插入的外源基因和穿梭载体骨架的条带切下，分别装在2 个1.5m.L 离心管中。
5. 将装着凝胶的离心管置于65°C 热激3~5min 。凝胶融化后按照下文所述准备连接反应：
| 穿梭载体骨架DNA | DNA总体积为10μL（最多为200ng） |
| 拟插入的外源基因DNA | 骨架：插入片段的分子比例为1：3 |
| T4DNA连接酶（5UμL） | 4μL |
| 连接酶缓冲液（5X） | 4μL |
| ATP（20mmol/L） | 4μL |
| H20 | 4μL |
连接反应混合物应在16℃过夜。
6. 第二天将连接反应物放在65 °C 热激3 ~ 5mm ，加入40μL 的S X KCM 缓冲液与140μL无核酸酶水，吹打混匀。冰上放置3 ~ 5mm 。将一个14mL 聚丙烯圆底试管放在冰上预冷。
7. 将DHSa E.coli 感受态细胞放在冰上融化，在SOμL 感受态细胞中加入25μL 稀释后的连接产物，将混合物加入圆底试管底部轻柔混合，冰上转化至少30min 。按照感受态细胞的说明书完成余下步骤。然后将加了50mg/L 卡那霉素的感受态细胞铺在LB 琼脂糖培养皿上， 37 °C 孵育过夜。
8. 将LB 培养皿放在UV 显微镜下，通过FITC 通道在510nm 波长下观察。在紫外光的激发下，已经被pSb-pkGFP 成功转化的质粒会发出绿色荧光。在其中挑选白色克隆放在2mL 的LB 培养基中（ 含50mg/L 卡那霉素）， 37 °C 摇床培养18h 。
9. 用小提质粒试剂盒从细菌培养物中提取质粒DNA 。用限制性内切核酸酶消化法鉴定确认pShuttle-Transgene 阳性克隆的质粒DNA 结构是否正确。