监测慢病毒载体储备液中的可复制型病毒

一、试剂

完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS )、慢病毒载体储备液、OptiMEM-I、青霉素／链霉素( P/S ) 溶液（100×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺（海美溴铵） ( 8mg/mL ) 、QuickTiter 慢病毒滴定试剂盒（慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶－EDTA ( 0.05%)

二、设备

培养板(12 孔）、恒湿细胞培养箱( 37 °C, 5% CO²)、血细胞计数器、微量移液器、450nm 可读微孔板酶标仪、带有无菌滤芯的移液器吸头（2 0μL 、2 00μL 和1000μL)、注射器式PVDF 膜过滤器( 0.45μm )、T-25 培养瓶、试管，无菌( 1.5mL )

三、方法

1 在转导前1 天， 向12 孔板上含lmL 完全培养基的每个孔中接种3 X10⁵个293T 细胞。37 °C 、5%CO²细胞培养箱培养过夜。

2 第1 天，将250μL 未浓缩载体储备液与含有16μg/mL 聚凝胺（1: 500 稀释8mg/mL聚凝胺储备液）的250μL 完全培养基混合。对于浓缩慢病毒载体储备液，加5μL 至含有8μg/mL 聚凝胺的0.5mL 完全培养基中。重复制备3 次。准备含有等体积OptiMEM-I 的试管，作为慢病毒载体储备液空白转导对照。

3 吸弃一个孔中的完全培养基，更换为含终浓度8μg/mL 聚凝胺的0.5mL 载体稀释液，重复该操作，载体储备液和空白对照各3 个复孔。在细胞培养箱中， 37 °C 、5%CO²培养过夜。

4 次日，将转染孔（ 载体储备液和空白对照） 中的上清移至无菌l.5mL 管中，再加入37 °C 预热的lmL 完全培养基。

5 在室温下以500g 离心第1 天的上清液10min 。将上清液转移到1 个新的试管中，标记为“第1 天”，标明载体或空白对照。－ 80 °C 储存。

6 第4 天，弃慢病毒和对照转染孔中的上清液，用lmL 的PBS 洗涤细胞。弃PBS,加入0.5mL 0.05 ％胰酶－EDTA, 室温孵育5min 。加入0.5mL 完全培养基，并通过反复吹打悬浮细胞。分别转移每孔中所有细胞至含5mL 完全培养基的T-25 培养瓶中（载体储备液和空白对照各需3 个培养瓶），在培养箱中继续培养。

7 . 第7 天，将培养上清液利用0.45μm 注射器式过滤器过滤到新的15mL 试管中，载体或对照均标记“第7 天” 。- 80 °C 储存。按照1 : 10 传代细胞， 每周2 次。

8 . 在第15 、21 和30 天重复步骤7 。

9 使用QuickTiter 慢病毒滴定ELISA 试剂盒测定所有上清液。对照包括载体储备液和293T 细胞上清液。第1 天的上清液中应含有来自慢病毒载体储备液的p24, 但它应该逐渐消失，在之后的时间点检测不到，与空白转导上清液水平相当。

配方

聚凝胺（海美溴铵） (8mg/mL)
溶解100mg 的凝聚胺（海美溴铵）于12.5mL 水中。利用0.22μm 过滤器除菌并存储在4 ℃

完全培养基

试剂	体积( 1L 中含）	终浓度
DMEM	890mL
FBS	100mL	10%
P/S 溶液(100 X)	10mL	1X