电穿孔转化感受态E.coli TG1细胞的制备

一、材料和试剂

1. 恒温旋转式摇床
2. 三角烧瓶（容量为1或2L）
3. 50ml灭菌离心管
4. 低温高速离心机
5. SB培养基

• 细菌培养用胰化蛋白胨     20g
• 细菌培养用酵母提取物      5g
• NaCl                     0.5g
• 去离子水                 950ml
• 250mmol/L KCl溶液        10ml

以5N的NaOH调节溶液的pH值至7.0，加去离子水至1L，高压蒸气灭菌。

6. 20%葡萄糖溶液
7. 1mol/L MgCl2溶液
8. 10%甘油

二、操作步骤

1. 从新鲜的LB平板培养物中挑选一个TG1克隆，接种于10m1 SB培养基中。
2. 37℃摇床培养过夜。
3. 取2.5ml培养物转接于0.5L SB中，另添加10ml 20%葡萄糖和5ml 1mol/L MgCl2。
4. 37℃培养直到OD600=0.7～0.8。
5. 将培养物置于冰浴15min，然后4000r/min于4℃离心20min，弃上清。
6. 将菌体重悬于1/2体积的预冷10%甘油中，4000r/min于4℃离心20min，弃上清。
7. 重复第（6）步骤。
8. 将菌体重悬于15ml 10%甘油，并转移至一支50ml的离心管中。3500r/min于4℃离心15min。小心地去掉上清，得到4～5ml细菌。迅速地将其吹打重悬；
9. 分装成200μl或40μl 的小份，操作应在乙醇/干冰浴中进行。贮存于-70℃。
10. 用pUC19质粒测试制备感受态细菌的转化效率，应达到109cfu/μg DNA。