新生大鼠骨骼肌细胞原代培养及肌管诱导分化

从新生大鼠的骨骼肌中分离成肌细胞（卫星细胞），在体外培养条件下，成肌细胞在培养底物上增殖，在诱导分化条件下，可迁移成直线排列，最终融合形成多细胞肌管。已有报道，将自体的骨骼肌细胞移植入心肌梗死后的瘢痕可改善心
肌功能。这些进展激发了科研人员对体外成肌细胞增殖、分化分子机制的基础研究。下面将介绍新生大鼠骨骼肌细胞的原代培养及肌管诱导分化。该方法也可用于小鼠、兔、猪或狗等动物骨骼肌成肌细胞的培养。

（ 一）材料与设备

1. 动物Wistar 新生大鼠（出生24~48h) 。

2. 试剂
（1） MEM-EBSS 培养液，进口优质胎牛血清( FBS), L－谷氨酰胺2mmol/L ,双抗试液（青霉素100U/ml、链霉素100μg/ml ) ，丙酮酸钠1mmol/L ， II 型胶原酶，D-Hanks 溶液， 0.25％胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液，马血清( HS) 。
（2）增殖培养液的配制： MEM-EBSS+15%~20% FBS＋双抗试液＋L-谷氨酰胺＋丙酮酸钠。
（3）分化培养液的配制： MEM-EBSS+2%FBS+10%HS＋双抗试液＋L-谷氨酰胺＋丙酮酸钠。

3. 设备
手术器械，细胞筛(100 目、200 目、400 目），离心机， CO₂ 培养箱， T25 细胞培养瓶，细胞培养皿（直径60mm), 24 孔板。

（ 二） 操作步骤

1. 取24~48h 新生大鼠胸大肌及股四头肌，用眼科剪将其剪成1mm³大小肉糜， 以D-Hanks 溶液冲洗2~3 次。
2. 以0.17％的胰蛋白酶和0.085％的 II 型胶原酶同时消化50~60min, 其间每10min 吹打1 次。
3. 离心（每分钟1000 转，10min) ，弃去上清液， 加入无血清的MEMEBSS培养液在培养皿中用20ml 注射器抽吸、吹打约10 次，以释放骨骼肌卫星细胞。
4 . 分别过100 目、200 目、400 目细胞筛网。
5. 收集细胞悬液于未经包被的培养皿或培养瓶中， 37 °C 静置45 ~60min, 通过差速贴壁法，去除大部分成纤维细胞。
6. 收集未贴壁细胞并计数，以每分钟1500 转的速率离心7min, 弃去上清液。
7. 以含15%~20%FBS 的MEM 增殖培养液重悬细胞， 在24 孔板中，以每孔4x 10⁵~6x 10⁵ 个/ml 接种细胞。注意，接种密度可根据实际需求确定，每孔最少不应低于1.5 x I0⁵ 个／ml； 接种密度与更换分化培养液的时间有关， 接种密度越高， 更换分化培养液的间隔时间越短，反之亦然。
8 . 细胞贴壁并增殖20~36h （根据接种密度决定），待细胞至60%~70％汇合时，可更换含2 % FBS 和10 %HS 的MEM 分化培养液，之后每24~48h更换1 次分化培养液 。
9. 每孔以1.5x 10⁵ 个/ml 的密度接种，可于3~4d 时出现肌管。注意，接种密度可影响肌管形成的时间及形态，接种密度越高，肌管形成越早，肌管数量越多，肌管越粗大。

（三）细胞鉴定

肌丝蛋白免疫细胞化学染色阳性。

（四）小结

组织以酶消化后，轻微机械研磨使肌纤维分离，释放出成肌细胞。不加诱导分化条件，体外可传代4 次。