小鼠胚胎成纤维细胞的培养

小鼠胚胎成纤维细胞(MEF) 作为原代培养细胞，其刺激增殖的能力强且可靠、易培养、来源丰富，常被用作干细胞培养的饲养层。一方面提供刺激干细胞增殖的各种因子，另一方面保持干细胞的未分化状态。虽然MEF 传代次数有限，但可早期冻存一些，不断复苏，保持长期使用。MEF 的缺点是无法耐受G418 的筛选。替代方法是从持续表达neo 抗性的小鼠品系或转基因品系来分离培养MEF 。利用各种转基因鼠培养的MEF 细胞还是各种基因功能研究的良好工具。

（一）材料

12.5~14.5d 的小鼠胚胎(3~6 只小鼠／次），培养皿（ 直径10cm), DMEM+10%新生牛血清， 15cm 或50cm 离心管（圆底）， PBS 配制的0.05％胰蛋白酶/EDTA0.02%消化液，手术刀、镊子、剪子等器械。

（二）操作步骤

1. 一般操作

(1) 在培养皿中，解剖出鼠胚，以Hanks 溶液消洗。
(2) 除掉四肢、大脑及内脏（肝脏） 。
(3) 用无菌Hanks 溶液＋PBS 漂洗3 次。
(4) 置培养皿中，用手术剪切碎。
(5) 将剪碎组织移入50ml 离心管中，加入约10ml 消化液。
(6) 37°C摇育10min （置水浴或孵育箱中）。
(7) 吸5ml 上清液放入另一50ml 离心管中，加等体积含10％新生牛血清的DMEM 培养液中和胰蛋白酶。
(8) 再加入4ml 消化液至原离心管（内含组织），颠倒摇动，10min 后再吸出5ml 上清液到另一离心管中，加入5ml 含10% 新生牛血清的DMEM 培养液。
(9) 重复上一步骤5 次左右，此时离心管中仅剩无法消化的软骨等。
(10) 离心50ml 离心管，加50ml 含10％新生牛血清的DMEM 培养液。
(11) 取适量移到培养皿或培养瓶中培养。
(12) 第二天换液，直到细胞长满（汇合），1 : 10 传代，再生长至合适密度时可进行冻存。
(13) 根据实验需要复苏细胞，由于MEF细胞传代数有限，实验时应尽可能保留相同代数的细胞进行平行实验。

2. 丝裂霉素处理或γ-射线处理  用作饲养层的MEF 细胞还须进行丝裂霉素处理或干射线处理，步骤如下。

（1） 丝裂霉素处理

• 复苏冻存的MEF 细胞(5×10⁴ 个/cm²，保证用时满满一层，不留空间。
• 汇合状态下的MEF 加入新配制的含10％新生牛血清、10μg/ml 丝裂霉紊的DMEM 培养液， 37 °C 、5% CO₂培养箱中培养2~3h 。
• 以PBS 彻底漂洗数次，胰蛋白酶消化，以每分钟1000 转的速率离心5min,收集沉淀，用新培养液悬浮，调整浓度为3×10⁵g 个/ml。
• 将细胞接种于经明胶预处理的培养皿中。（明胶预处理： 0.1％明胶溶液浸泡2h, 移走多余的明胶，待自然干燥。）

(2)γ-射线处理

• 汇合状态的MEF 细胞，以30~ 100Gy 的γ－射线处理。
• 胰蛋白酶消化，收集细胞，离心（每分钟1000 转， 10min )、计数，接种到明胶预处理的培养皿中。Y-射线处理过的细胞也可以5×10⁶ 个／ml 的浓度冻存起来。复苏后， 1 支冻存管可接种到4~5 块直径6cm 的培养皿中。