实时荧光定量PCR实验步骤

1、样品RNA的抽提

①取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
②两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的氯仿，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚氯仿相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
③RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
④RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH₂O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
⑤RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
⑥溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。

2、RNA质量检测

1）紫外吸收法测定
先用稀释用的TE溶液将分光光度计调零。然后取少量RNA溶液用TE稀释（1:100）后，读取其在分光光度计260nm和280nm处的吸收值，测定RNA溶液 浓度和纯度。
① 浓度测定
A260下读值为1表示40 µg RNA/ml。样品RNA浓度(µg/ml)计算公式为：A260 ×稀释倍数× 40 µg/ml。具体计算如下：
RNA溶于40 µl DEPC水中，取5ul，1:100稀释至495µl的TE中，测得A260 = 0.21
RNA 浓度= 0.21 ×100 ×40 µg/ml = 840 µg/ml 或 0.84 µg/µl
取5ul用来测量以后，剩余样品RNA为35 µl，剩余RNA总量为：
35 µl × 0.84 µg/µl = 29.4 µg
②纯度检测
RNA溶液的A260/A280的比值即为RNA纯度，比值范围1.8到2.1。
2）变性琼脂糖凝胶电泳测定
①制胶
1g琼脂糖溶于72ml水中，冷却至60℃，10 ml的10× MOPS电泳缓冲液和18 ml的37% 甲醛溶液(12.3 M)。
10×MOPS电泳缓冲液
浓度       成分
0.4M     MOPS，pH 7.0
0.1M     乙酸钠
0.01M   EDTA
灌制凝胶板，预留加样孔至少可以加入25 µl溶液。胶凝后取下梳子，将凝胶板放入电泳槽内，加足量的1×MOPS电泳缓冲液至覆盖胶面几个毫米。
②准备RNA样品
取3µgRNA，加3倍体积的甲醛上样染液，加EB于甲醛上样染液中至终浓度为10µg/ml。加热至70℃孵育15分钟使样品变性。
③电泳
上样前凝胶须预电泳5min，随后将样品加入上样孔。5–6V/cm电压下2h，电泳至溴酚兰指示剂进胶至少2–3cm。
④紫外透射光下观察并拍照
28S和18S核糖体RNA的带非常亮而浓（其大小决定于用于抽提RNA的物种类型），上面一条带的密度大约是下面一条带的2倍。还有可能观察到一个更小稍微扩散的带，它由低分子量的RNA（tRNA和5S核糖体RNA）组成。在18S和28S核糖体带之间可以看到一片弥散的EB染色物质，可能是由mRNA和其它异型RNA组成。RNA制备过程中如果出现DNA污染，将会在28S核糖体RNA带的上面出现，即更高分子量的弥散迁移物质或者带，RNA的降解表现为核糖体RNA带的弥散。用数码照相机拍下电泳结果。

3、样品cDNA合成
①反应体系
序号     反应物                   剂量
1         逆转录buffer            2μl
2        上游引物                  0.2μl
3        下游引物                  0.2μl
4        dNTP                       0.1μl
5        逆转录酶MMLV       0.5μl
6        DEPC水                     5μl
7        RNA模版                    2μl
8        总体积                      10μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②混合液在加入逆转录酶MMLV 之前先70℃干浴3分钟，取出后立即冰水浴至管内外温度一致，然后加逆转录酶0.5μl，37℃水浴60分钟。
③取出后立即95℃干浴3分钟，得到逆转录终溶液即为cDNA溶液，保存于-80℃待用。

4、梯度稀释的标准品及待测样品的管家基因（β-actin）实时定量PCR
①β-actin阳性模板的标准梯度制备 阳性模板的浓度为1011，反应前取3μl按10倍稀释（加水27μl并充分混匀）为10¹⁰，依次稀释至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴，以备用。
②反应体系如下：
标准品反应体系
序号           反应物               剂量
1       SYBR Green 1 染料     10μl
2      阳性模板上游引物F     0.5μl
3      阳性模板下游引物R    0.5μl
4      dNTP                           0.5μl
5     Taq酶                           1μl
6      阳性模板DNA              5μl
7      ddH₂O                          32.5μl
8      总体积                           50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
管家基因反应体系：
序号             反应物                  剂量
1           SYBR Green 1 染料      10μl
2           内参照上游引物F         0.5μl
3           内参照下游引物R        0.5μl
4           dNTP                           0.5μl
5           Taq酶                           1μl
6           待测样品cDNA             5μl
7           ddH₂O                         32.5μl
8           总体积                          50μl

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
③制备好的阳性标准品和检测样本同时上机，反应条件为：93℃　2分钟，然后93℃ 1分钟，55℃ 2分钟，共40个循环。

5、 制备用于绘制梯度稀释标准曲线的DNA模板
①针对每一需要测量的基因，选择一确定表达该基因的cDNA模板进行PCR反应。
反应体系：
序号             反应物                  剂量
1             10× PCR缓冲液        2.5 ul
2              MgCl₂ 溶液             1.5 ul
3             上游引物F                0.5 ul
4             下游引物R                0.5 ul
5             dNTP混合液             3 ul
6             Taq聚合酶                1 ul
7             cDNA                       1 ul
8             加水至总体积为        25ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
35个PCR循环（94℃1分钟；55℃1分钟；72℃1分钟）； 72ºC延伸5分钟。
②PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。
③将PCR产物进行10倍梯度稀释: 将PCR产物进行10倍梯度稀释: 设定PCR产物浓度为1×10¹⁰，依次稀释至10⁹、10⁸、10⁷、10⁶、10⁵、10⁴几个浓度梯度。

6 、待测样品的待测基因实时定量PCR
①所有cDNA样品分别配置实时定量 PCR反应体系。
体系配置如下：
序号          反应物                剂量
1       SYBR Green 1 染料     10 ul
2       上游引物                     1ul
3       下游引物                     1ul
4        dNTP                           1ul
5       Taq聚合酶                   2ul
6        待测样品cDNA            5ul
7       ddH₂O                        30ul
8       总体积                        50 ul

轻弹管底将溶液混合，6000rpm短暂离心。
②将配制好的PCR反应溶液置于Realtime PCR仪上进行PCR扩增反应。反应条件为：93℃2分钟预变性，然后按93℃ 1分钟，55℃1分钟，72℃1分钟，共40做个循环，最后72℃7分钟延伸。

7 、实时定量PCR使用引物列表
引物设计软件：Primer Premier 5.0，并遵循以下原则：引物与模板的序列紧密互补；引物与引物之间避免形成稳定的二聚体或发夹结构；引物不在模板的非目的位点引发DNA 聚合反应(即错配)。

8 电泳
各样品的目的基因和管家基因分别进行Realtime PCR反应。PCR产物与 DNA Ladder在2％琼脂糖凝胶电泳，GoldView™染色，检测PCR产物是否为单一特异性扩增条带。