原位杂交实验流程

1.探针的设计与合成

• 根据实验室已有的p8基因cDNA全长序列，用premier primer5.0设计引物p81和p82，以卤虫cDNA为模板，PCR扩增得到346bp的产物，回收纯化。

引物编号	引物序列	长度
p81	TGCGGACGAAACAGGAAG	18 bp
p82	GCTCAAACAGTGATGCCAGT	20 bp

• 目的片段克隆
  1）在无菌离心管中加入连接载体的各种成分，载体与片段的摩尔比控制在1:3-1:8，根据凝胶电泳检测后的浓度及载体与片段分子大小来计算摩尔比。加入成分及比例如下：

  目的PCR片段	5 μl
  pGM-T载体（约50ng/uL）	1 μl
  10×T4 DNA Ligation Buffer	1 μl
  T4 DNA Ligase（3U/uL）	1 μl
  无菌去离子水	3 μl
  总体积	10 μl

  
  2）轻轻弹动离心管以混合内容物，短暂离心。置于PCR仪中16℃过夜连接，反应结束后将离心管置于冰上。
  3）向铺好的含有氨苄青霉素的固体平板表面加入16 μl的IPTG（50mg/ml）、40 μl的X-gal（20mg/ml），使用无菌的弯头玻璃棒将其均匀的涂开，避光置于37℃培养箱1-3小时，使溶解X-gal的二甲基甲酰挥发干净。
  4）将10 μl的连接产物加到100 μl DH5a感受态细胞中，轻弹混匀，冰浴半小时，将离心管置于42℃水浴90秒，取出管后立即置于冰浴上放置2-3分钟，其间不要摇动离心管。向离心管加入500 μl 37℃预热的LB（不含抗生素）培养基，150rpm摇床37℃振荡培养45分钟。目的是使质粒上相关的抗性标记基因表达，使菌体复苏。将菌液于4000g下离心10分钟，去掉上清，加入100 μl培养液重溶并加入到配制好的LB固体培养基上，用无菌的弯头玻璃棒轻轻将细胞均匀涂开。待平板表面干燥后，倒置平板，37℃培养12-16小时。
  5）挑取白色菌落直接进行PCR检测，筛选转化子。
  6）将转化子接种于LB液体培养基中培养24小时，吸取1mL菌液送至大连宝生物公司进行序列测序。

• 重组质粒的线性化

取6 μl以测序的重组质粒，选取NcoI内切酶37℃酶切4h。酶切反应体系为20 μl：

质粒	6 μl
10xK Buffer	2 μl
NcoI酶	1 μl
0.1% BSA	2 μl
灭菌水	9 μl
终体积	20 μl

取酶切前后的质粒各4 μl，经1%琼脂糖电泳检测，确认酶切完全，将酶切产物用Takara胶回收试剂盒回收纯化，作为探针合成的模板。

• 探针合成

按试剂盒使用指南，标记反义RNA探针。

使用的所有试剂和器皿均经去RNase处理，合成方法如下：先准备反应体系。冰上向RNase-Free的微离心管中顺序加入下列试剂:

纯化的线形质粒	1 μg
Rnase-free dH2O	up to 13 μl
10xNTP labeling mixture	2 μl
10xTranscription buffer	2 μl
Rnase inhibitor	1 μl
SP6 RNA Polymerase	2 μl
总体积	20 μl

稍混匀，短暂离心将反应液集于管底，37℃ 2 h。反应结束后再补加2 μl DNase I，37℃ 15 min，反应结束后加入0.2M EDTA 2 μl 终止反应。取3-5 μl 反应产物1%琼脂糖凝胶电泳检测。-20℃保存备用。

2.石蜡切片的制备

◆本实验在杂交结束前均必须保证RNase-free.玻璃器皿采用180℃烘烤10小时。其它采用DEPC处理，高温灭菌锅高温降解DEPC。若仪器不能高温处理，可用3%的H2O2处理半小时以上，DEPC水冲洗干净，烘干。

• 组织的固定与包埋

选取不同发育时期（0h，5h，10h，15h，20h，40h，3d，5d，7d）的卤虫，经DEPC处理水冲洗表面盐分后，加入新鲜配制的4%多聚甲醛，于4℃固定5-8 h，再分别按下列顺序进行脱水、透明和包埋: 30%乙醇脱水1 h，50%乙醇脱水1 h，70%乙醇脱水1 h，80%乙醇脱水乙醇脱水1 h，90%乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇脱水1 h，无水乙醇:二甲苯(1:l)透明10 min，二甲苯透明10 min、二甲苯:54℃石蜡(1:1)浸蜡30 min，54℃石蜡浸蜡1 h，54℃石蜡包埋。

• 组织切片：将包埋的组织按7 μm的厚度切片，在多聚赖氨酸处理的载玻片上滴加DEPC处理水，组织片于42℃展片台上展片1小时，再置于40℃恒温箱中烘片12小时后放于4℃密封保存备用。

3.杂交前处理

切片经二甲苯脱蜡2×15 min，无水乙醇:二甲苯(1:l) 5 min，100%-95%-80%-50%-30%乙醇脱水各5 min，后DEPC处理水2×5 min，然后进行杂交前切片处理，具体步骤如下:

• lxPBS(pH7.4)室温孵育2×5 min。
• 3%TtitonX-100的PBS中去膜处理15 min。
• lxPBS洗涤2×5 min。
• 无RNase的蛋白酶K(20 mg/mL)37℃消化30 min。
• 100mMGly/PBS中洗2×5 min。
• lxPBS洗涤2×5 min。
• 4%多聚甲醛(4℃)固定5min。
• lxPBS洗涤2×5 min。
• 含有25%(W/v)的乙酸酐的100mM的三乙醇胺缓冲液(pH8.0)去电荷处理15 min(现配现用)。
• lxPBS洗涤2×5 min。

4.预杂交和杂交

• 滴加预杂交液于载玻片上，然后置于湿盒中，50℃预杂交2小时。
• 弃去预杂交液，立即滴加杂交液，置于湿盒中52℃杂交过夜。

5.杂交后处理

杂交完，以后的步骤不必要特意防RNA酶。

• 弃去杂交液，载片浸入2xSSC中2×15 min。
• 载片浸入1xSSC中55℃水浴摇动2×15 min。
• 用含20mg/mL的RNaseA的NTE缓冲液37℃消化30分钟，以去除未结合的探针。
• 载片浸入5xSSC中55℃水浴摇动2×15 min。
• 载片浸入5xSSC中室温10 min。

6.抗体反应

• 用washing buffer清洗组织片5 min。
• 滴加封闭液缓冲液室温下处理组织片30 min。
• 用抗体液覆盖封闭后的组织片，置于湿盒中孵育3h以上。
• Washing buffer 洗2×15 min。
• Detection buffer 中平衡2-5 min。

7.显色：加入显色液于湿盒中黑暗静止显色16h

8.封片与观察：

• 显色合适时，用TE buffer终止着色反应，再用蒸馏水清洗。
• 滴加封片剂封片，显微镜下观察和摄影。