动物基因组DNA的提取

实验原理

 在EDTA和SDS等去污剂存在下，用蛋白酶K消化细胞，随后用酚抽提，可以得到哺乳动构基因组DNA，用此方法得到的DNA长度为100-150 kb，适用于构建基因组文库和 Southern分析。

通过本实验了解并掌握提取基因组DNA的原理和步骤，以及相对分子质量较大的DNA的琼脂糖凝胶电泳技术。

仪器、材料与试剂

(一)仪器

1 . 台式离心机

2 . 玻璃匀浆器

3 . 高压灭菌锅

4 . 恒温水浴锅

(二)材料

1．1.5mL微量离心管

2．微量取样器和吸头

3．无菌过滤器(一次性)

4．10 mL注射器

5．鼠肝

6．三羟甲基氨基甲烷(Tris)

7.十二烷基硫酸钠(SDS)

 8．乙二胺四乙酸(EDTA)

 9．蛋白酶K

10．RNA酶

11．DNA相对分子质量标准物，DNA／EcoRI+HindⅢ相对分子质量标准物

 (三)试剂

1、1.5 mol／L    NaCl

2、0.5 mol／L Tris·HCI    pH8.0

3．0.5 mol／L EDTA    pH8.0

4．3 mol／L NaAc    pH5.2

 以上均高压灭菌。

5．蛋白酶K  10mg／mL配好后用一次性过滤器过滤，-20 ℃ 保存

6 .  组织匀浆液  100mmol／LNaCI，10mmol／LTris·HCl(pH 8.0)，0.25mmol／LEDTA(pH8.0)

7．酶解液  200mmol／LNaCI，20mmol／L Tris·HCI(pH 8．O)，50mmol／LEDTA(PH 8.0)，200~g／mL蛋白酶K，1％SDS

8．无DNA酵的RNA酶 ： 将胰RNA酶溶解于10mmol／L Tris.HCI(pH7.5)、15 mmol／L  NaCl溶液中，浓度l0mg／mL，于100℃水浴处理15min，以降解DNA酶，缓慢冷却到室温，-20℃保存

9．TE缓冲液 ：10mmol／LTris·HCl(pH8.0)，25 mmol／LEDTA(pH8.0)

10．平衡酚(pH8.0)：氧仿：异戊醇=25：24：1（体积比）

11．氧仿：异戊醇=24：1(体积比)

12．5xTBE  5．4gTris，2．75g硼酸  2mL 0.5mol／L EDTA(pH8.0)，加水到100mL；

13．6x上样缓冲液  0.25％溴酚蓝，40％(W／V)蔗糖水溶液

14．λDNA／EcoRI+／HindⅢ 相对分于质量标准物片段(bP)21 227，5148，4 973，4 268，3 530，2 027，1 904，1 584，1 315，947，831，564，125

实验步骤

    本实验在无液氮的条件下，制备鼠肝DNA，与有液氮条件下相比，产量和质量都有所下降。整个操作过程中，应尽量避免DNA酶的污染，特别注意动作温和，减少对DNA的机械损伤。

1、取0.2g鼠肝，用冰冷的生理盐水洗3次，然后置于2.0mL匀浆液中，用玻璃匀浆器匀浆至无明显组织块存在(冰浴操作，切勿将细胞破碎，可镜检观察)。

2、将组织细胞移至1.5ml离心管中，50000rpm离心30-60sec，(尽可能在低温下操作)，弃上清，若沉淀中血细胞较多，可再加入细胞体积的一倍匀浆液洗一次。

3、沉淀加0.8mL无菌水迅速吹散，分两管，再加0.4mL酵解液，翻转混匀(动作一定要轻)55℃水浴处理12-18 h；

4、沉淀加RNase至终浓度200µg／mL，37℃水浴1 h；

5、加入等体积酚／氯仿／异戊醇抽提一次，(慢慢旋转混匀，倾斜使两相接触面增大)。4℃、10min、10000rpm离心；

6、有时如果DNA含量过高，水相在下层，实验时应注意观察。用吸头移出含DNA的水相(注意勿吸出界面中蛋白沉淀)，加等体积氧仿／异戊醇，4℃、10 000rrpm离心10rain (若界面或水相中蛋白含量多，可重复1．6操作)。

7、用吸头小心吸出上层含DNA的水相，加1／10体积的NaAc，小心混匀(要充分)，再向每管中加入2.5倍体积的无水乙醇，-20℃  过夜。

8、12 000rpm离心19min，弃上清，75％冷乙醇洗涤一次，12000rpm离心15min室温干燥(不要太干，否则DNA不易溶解)，加入适量TE缓冲液，存放于4℃，轻摇溶解过夜，即可得到实验动物基因组DNA。

9、电泳鉴定DNA，由于基因组DNA相对分子质量较大，用0.3％的琼脂糖凝胶电泳鉴定，先在底部铺一层1％的支持胶，凝固后再铺上一层0.3％琼脂糖凝胶，插上梳子(梳子不能碰到支持胶)。取1.5µL溶解的DNA、1µL上样缓冲液和35µl无菌水混匀后小心上样(可在另一孔加DNA相对分于质量标准)，观察基因组DNA大小，用溴化乙锭染色观察结果。

[注意事项]

1、操作过程尽量在低温下进行，避免DNA降解。

2、琼脂糖凝胶脆弱，应小心操作。

3、提取得到的基因组DNA应为单一条带，DNA降解可形成弥散带型。