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该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。
试剂
琼脂糖凝胶( 1 %)
复性缓冲液( 10 X)
ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )
二硫苏糖醇( DTT ) ( 1mol/L)
DNA 分子质量标准
dNTP 混合液，每种10mmol/L
乙醇( 100％和70%)
Ficoll-Orange G 上样缓冲液( 6 X)
非变性凝胶上样缓冲液( 10 X)
无核酸酶水
寡核昔酸引物
PCR 缓冲液( 10 X) <R>
酚： 氯仿( 1 : 1, VIV)
无RNA 酶的胰腺DNA 酶Ⅰ ( 2U/μL)
乙酸钠( 3mol/L , pH 5.2 )
SYBR Gold ( 10000 X) 或者溴化乙锭（10mg/mL)
T7RNA 聚合酶( 20U/ μL)
T7 转录缓冲液（10 X)
TAE 缓冲液( 50 X , 1 X)
Taq DNA 聚合酶( 2.5U/μL)
TBE 缓冲液( 5 X , 0.5 X)
PCR 用DNA 模板
设备
琼脂糖凝胶电泳仪
离心机
微量离心管(1.5m.L)
PCR 管(0.5mL, 薄壁）
Primer3 软件
分光光度计
热循环仪
涡旋振荡器
方法
制备体外转录用DNA 模板
1 在有关的数据库或者根据序列数据，分析目的基因的mRNA 、cDNA 或者基因组序列。
2 选择长度为500~800bp 的靶区域作为dsRNA 模板。
3 利用BLASTn 有义链和反义链进行同源性分析。如果某条链与非目的靶基因同源，则重复步骤2 。
4. 用Primer3 软件设计长度为20 ~ 24 个核昔酸的正向和反向引物，使其Tm值约为60°C（http://primer3.sourceforge.net/) 。
5. 将T7 启动子序列( 5′-TAATACGACTCACTATAGGG-3′) 加到两条引物的5’端。需要准备带有或者不带有T7 启动子序列的正向和反向引物（两对引物） 。
6 分别进行两套PCR 反应，生成RNA 有义链和反义链所使用的DNA 模板。每生成一个DNA 模板，需要将下列试剂在 1.5mL 试管中配制成一个500μL 的PCR 体系：
| 模板DNA |
—a |
| 无核酸酶水 | 加至395μL |
| PCR 缓冲液( 10 X) | 50μL |
| dNTP 混合液（每种10mmol) | 10μL |
| 正向引物（ 10μmol ) | 20μL |
| 反向引物( 10μmol ) | 20μL |
| Taq DNA 聚合酶 | 5μL ( 12.5U ) |
| 总反应体积 | 500μL |
a 用作PCR 的模板，使用0.05 ~100ng 克隆的质粒或噬菌体DNA , 0. 5~ 5μg 基因组DNA, 或者10~20μL 反转录反应生成的cDNA 。
7 轻微混合，涡璇离心1 ~ 2s 将试剂甩至试管底部，然后将其分装到为0.5mL 薄壁PCR管中，每份100μL 。
8 将试管放入热循环仪中，按下列程序进行25 个扩增循环：
i. 94 ℃ 2min
ii. 94℃ 45s
iii. 50℃ 45s
iv. 72℃ 60s
v 再次重复ii~iv, 24 个循环。
vi. 72 °C 5min
vii. 4 °C 保存
viii. 结束
9 同时，用TAE 缓冲液制备一块1 ％的琼脂糖凝胶 。
10. PCR 反应结束后，将5μLPCR 产物与1μL 6X Ficoll Orange G 上样缓冲液混合后上样通过电泳分析PCR 产物。Orange G 染料位于电泳的前沿而不会在电泳时遮盖任何条带。
11. 将步骤10 剩余的DNA 扩增产物转移至一个新的1.5mL 微量离心管中，加入1/10体积的乙酸钠（3mo l/L, pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min, 弃去上清。
12. 用1mL 70％乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min, 最大可能地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
13. 将DNA 沉淀溶解于50μL 水。
制备dsRNA
14. 将T7RNA 聚合酶置于冰上放置，其他试剂室温放置。室温下，按下列配方在1.5mL微量离心管中配制一个100μL 的体外转录体系：
| 无核酸酶水 | 56.5μL |
| T7 转录缓冲液( 10 X) | 10μL |
| PCR 模板DNA | 5μL |
| ATP ( 100mmol/L） | 5μL |
| CTP (100mmol/L ) | 5μL |
| UTP ( 100mmol/L） | 5μL |
| GTP （100mmol/L） | 8μL |
| OTT ( 1mol/L) | 0.5μL |
| T7RNA 聚合酶 | 5μL (100U) |
如果实验需要更多的RNA, 等比例扩大反应体系。
15 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂离心至试管底部。
16 37°C 孵育2h 。
17 加入5μL （ 10U) 无RNA 酶的胰腺DNA 酶I (RNase-free pancreatic DNase I) 。
18 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂甩至试管底部。
19 37°C 孵育30min 。
20 加入等体积的酚：氯仿( 1 : 1, VIV) ，涡旋20s 。4°C 最大转速离心15min, 分离固相、液相，将液相层转移至一个新的1.5mL 微量离心管中。
21 向液相中加入1/10 体积的乙酸钠( 3mol/L ， pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min 。
22 弃去上清。加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min 使RNA 沉淀，最大限度地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
23 将RNA 沉淀溶解于100 μL 的无核酸酶水中。利用吸收光分光光度计测量RNA 的浓度。
24 使两条链复性， 生成0.5μmol/L 的dsRNA 溶液：
| 正义RNA | 50pmol |
| 反义RNA | 50pmol |
| 复性缓冲液( 10 X) | 10 μL |
| 无核酶水 | 加至100 μL |
25 将试管放在热循环仪中， 95°C 1min, 关闭热源使温度缓慢降至室温。
26 按照步骤21 、步骤22 的方法沉淀RNA 。
27 将沉淀溶于水中，制成lμg/μL 的储备液，－8 0 °C 保存。
检查dsRNA 的完整性
28 用0.5 X TBE 缓冲液配制一块1％的琼脂糖凝胶。
29 将dsRNA （步骤27 中得到的）和ssRNA （步骤23 中得到的有义链和反义链，作为对照使用）溶解于1 X 非变性凝胶上样缓冲液中，终浓度为0.1 μg/μL 。
30 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 缓冲液中进行电泳，恒压75V 。
31 电泳结束后， 室温下用SYBR Gold ( 1 : 10000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液） 或者溴化乙锭( 1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液）染色10 min, 在紫外光下观察RNA 条带。
疑难解答
问题（步骤23) ： 没有检测到转录产物。
解决方案： 更换连接到引物上的T7 启动子（步骤5 ) 。
检查体外转录使用的试剂（步骤14 ) ； 确认所有的试剂都已添加，并且T7 聚合酶有活性。使用新鲜的NTP 和DTT 进行体外转录反应。
问题（步骤31) ： 发现污染条带或与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带。
解决方案： 凝胶中有污染条带表明由于RNA 酶的污染导致RNA 降解。要求实验全程都要戴手套，并且要经常更换。使用无RNA 酶的试剂、试管和移液器吸头。使用RNA 凝胶电泳专用的TBE 缓冲液和电泳装置。与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带表明DNA酶Ⅰ 失活。对于仍然含有带有模板DNA （步骤23 中） 的体外转录RNA （步骤16 ) 或纯化后的RNA 要用不同批次DNA 酶Ⅰ（来自步骤17 ～ 步骤19 ) 处理，并重复纯化和复性过程（步骤20 ～步骤27 ) ，然后再进行电泳检测dsRNA （步骤28～步骤31 ) 。
配方
复性缓冲液(10 X)
| 试剂 | 数量（ 以100 mL 计） | 终浓度( 10 X) |
| 乙酸钾( 2mol/L） | 50mL | 1mol/L |
| HEPES －氢氧化钾( 1mol/L, pH 7.4 ) | 30mL | 300mmol/L |
| 乙酸镁（1mol/L ） | 2mL | 20mmol/L |
| 水 | 补足100mL | |
| 室温保存。 |
Ficoll-Orange G 上样缓冲液(6 X)
| 试剂 | 数量（以100mL 计） | 终浓度(6X) |
| Ficoll-400 | 15g | 15% ( m/V) |
| Orange G | 250mg | 0 25% (m/ V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为1mL, -20 ℃保存。 |
非变性凝胶上样缓冲液(10 X )
| 试剂 | 数量（以100 mL 计） | 终浓度( 10 X) |
| Ficoll-400 | 15g | 15% ( m/V) |
| 二甲苯蓝 | 250mg | 0 25% ( m/V) |
| 溴酚蓝 | 250mg | 0.25% (m/ V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为1mL , -20℃ 保存。 |
PCR 缓冲液( 10 X)
| 试剂 | 数量（以100mL 计） | 终浓度(10 X) |
| Tris-HCI ( 1 mol/L, pH 8.3) | 10mL | 100mmol/L |
| KCI ( 2mol/L ) | 25mL | 500mmol/L |
| MgCl2 ( 1 mol/L ) | 1.5mL | 15mmol/L |
| 明胶(Gelatin) ( 2%, m/V) | 5mL | 0.1% (m/V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为lmL , -20℃ 保存。 |
T7 转录缓冲液( 10 X)
| 试剂 | 数量（以100mL 计） | 终浓度(10 X) |
| Tris-HCI ( 1 mol/L, pH 7 9) | 40mL | 400mmol/L |
| 亚精胺(Spermiodine ) (1mol/L) | 2.5mL | 25mmol/L |
| MgCl2 (1mol/L) | 26mL | 260mmol/L |
| Triton X-100 | 1mL | 0.1 % (m/V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为1mL， －20℃ 保存。 |
请问T7加启动子的目的是什么
T7就是一种启动子系统。T7 启动子是转录起始位点+1 (5′ – TAATACGACTCACTATAG – 3′)前端18 bp长度的DNA序列，可被T7 RNA 聚合酶识别1。 T7启动子常用于调节重组蛋白的基因表达，支持各种下游研究应用。
请问怎么知道mRNA的靶区域在哪？还有就是只要在靶区域的片段用BLAST显示的是特异性的就可以随便取吗？
在体外转录法制备dsRNA（双链RNA）的过程中，确定mRNA的靶区域是关键的一步。以下是一些常用的方法和步骤，以帮助确定mRNA的靶区域：
1. 目标基因的选择
首先，确定你想要抑制或研究的目标基因。你需要有这个基因的完整序列信息（通常从基因数据库中获得，如NCBI）。
2. 设计siRNA或shRNA序列
设计小干扰RNA（siRNA）或小发夹RNA（shRNA）的序列，这些序列将与目标mRNA的特定区域互补。设计时需要考虑以下几点：
靶区域的长度：通常选择21-23个核苷酸长的靶序列。
避免高度保守区域：选择特异性较高的区域，避免选择高度保守的序列，以减少脱靶效应。
避免二级结构：靶区域应尽量避免复杂的二级结构（如发夹结构），以确保dsRNA能够有效结合。
区域选择：一般选择目标mRNA的编码区（CDS）或3’非翻译区（3’UTR）作为靶区域。
3. 靶序列的筛选
使用生物信息学工具对靶序列进行筛选和优化：
BLAST比对：使用BLAST工具比对选择的序列，确保其特异性，即与非目标基因的相似性较低。
RNA二级结构预测：使用RNA结构预测软件（如RNAfold）预测所选靶序列的二级结构，确保其具有良好的结合特性。
4. 合成引物
根据设计的靶序列，合成适合体外转录的引物。通常，这些引物包括T7或其他RNA聚合酶启动子的序列，以便后续的体外转录。
5. 体外转录
利用合成的引物和模板进行体外转录，生成dsRNA。使用T7 RNA聚合酶或其他适合的RNA聚合酶进行体外转录反应。
6. 验证dsRNA的有效性
将制备好的dsRNA导入细胞或体内系统，验证其对目标基因mRNA的沉默效果：
qRT-PCR：检测目标mRNA的表达水平，确认dsRNA是否有效降低了目标基因的mRNA水平。
Western blot：检测目标蛋白的表达水平，确认dsRNA是否有效降低了目标基因的蛋白水平。
实际操作中常用的工具和软件：
BLAST：核酸序列比对工具，帮助确定靶序列的特异性。
RNAfold：RNA二级结构预测工具，帮助评估靶序列的二级结构。
Primer设计软件：设计适合的引物序列。
通过上述步骤和方法，你可以确定并验证mRNA的靶区域，从而成功制备有效的dsRNA。
请问预测完二级结构后怎么判断这一段可不可以用来做靶序列？如果无法避免二级结构这部分，有没有什么方法可以提供合成的dsRNA的质量？
在预测完RNA的二级结构后，可以通过以下几个方面来判断该序列是否适合作为靶序列：
靶序列的二级结构：
无明显的发夹结构：对于siRNA和shRNA来说，目标序列不应形成稳定的发夹结构，因为这可能会影响其与靶mRNA的结合。
开放区域：优先选择在RNA二级结构中较为开放的区域，这样更容易与靶mRNA结合。
能量评分：
使用RNA二级结构预测工具（如RNAfold）计算预测的自由能（ΔG）。较低的ΔG值表示更稳定的二级结构，不利于靶序列的可及性。
靶序列的位置：
通常选择位于mRNA编码区（ORF）或者3’非翻译区（3’UTR）中间部分的序列，因为这些区域通常是较为保守的，且二级结构较少。
提高合成dsRNA质量的方法
序列优化：
避免重复序列：重复序列可能会形成不希望的二级结构。
合理设计GC含量：过高或过低的GC含量都会影响二级结构的稳定性，通常40-60%的GC含量较为合适。
使用化学修饰：
2′-O-甲基修饰：这种修饰可以提高dsRNA的稳定性和特异性，减少脱靶效应。
磷酸酯骨架修饰：例如在两端进行磷酸酯修饰，可以提高dsRNA的稳定性和抗降解能力。
体外合成和质控：
体外转录和纯化：使用高质量的模板进行体外转录合成dsRNA，并通过纯化步骤去除反应中的杂质和未反应的成分。
测序验证：通过高通量测序验证合成的dsRNA序列，以确保没有错误和突变。
凝胶电泳分析：使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析合成的dsRNA的完整性和纯度。
功能验证：
体外细胞实验：将合成的dsRNA在细胞系中进行转染实验，验证其靶向效果和下调靶基因的效率。
qRT-PCR和Western Blot：通过qRT-PCR检测靶mRNA的表达水平，通过Western Blot检测靶蛋白的表达水平，确认dsRNA的有效性。
这些方法结合使用，可以显著提高合成dsRNA的质量和靶向效率，从而提高实验的成功率和数据的可靠性。