英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
该方案是简单而且得到广泛应用的、利用PCR 模板制备双链RNA 的体外转录反应。该方法制备的dsRNA 可以用于在某些细胞或者组织中诱发RNA 干扰。
试剂
琼脂糖凝胶
复性缓冲液
ATP 、CTP 、GTP 、UTP （ 每种100mmol/L )
二硫苏糖醇
DNA 分子质量标准
dNTP 混合液，每种10mmol/L
乙醇
Ficoll-Orange G 上样缓冲液
非变性凝胶上样缓冲液
无核酸酶水
寡核昔酸引物
PCR 缓冲液
酚： 氯仿( 1 : 1, VIV)
无RNA 酶的胰腺DNA 酶Ⅰ
乙酸钠
SYBR Gold
T7RNA 聚合酶
T7 转录缓冲液（10 X)
TAE 缓冲液
Taq DNA 聚合酶
TBE 缓冲液
PCR 用DNA 模板
设备
琼脂糖凝胶电泳仪
离心机
微量离心管
PCR 管(0.5mL, 薄壁）
Primer3 软件
分光光度计
热循环仪
涡旋振荡器
方法
制备体外转录用DNA 模板
1 在有关的数据库或者根据序列数据，分析目的基因的mRNA 、cDNA 或者基因组序列。
2 选择长度为500~800bp 的靶区域作为dsRNA 模板。
3 利用BLASTn 有义链和反义链进行同源性分析。如果某条链与非目的靶基因同源，则重复步骤2 。
4. 用Primer3 软件设计长度为20 ~ 24 个核昔酸的正向和反向引物，使其Tm值约为60°C（http://primer3.sourceforge.net/) 。
5. 将T7 启动子序列
6 分别进行两套PCR 反应，生成RNA 有义链和反义链所使用的DNA 模板。每生成一个DNA 模板，需要将下列试剂在 1.5mL 试管中配制成一个500μL 的PCR 体系：
| 模板DNA |
—a |
| 无核酸酶水 | 加至395μL |
| PCR 缓冲液 |
50μL |
| dNTP 混合液（每种10mmol) | 10μL |
| 正向引物（ 10μmol ) | 20μL |
| 反向引物 |
20μL |
| Taq DNA 聚合酶 | 5μL |
| 总反应体积 | 500μL |
a 用作PCR 的模板，使用0.05 ~100ng 克隆的质粒或噬菌体DNA , 0. 5~ 5μg 基因组DNA, 或者10~20μL 反转录反应生成的cDNA 。
7 轻微混合，涡璇离心1 ~ 2s 将试剂甩至试管底部，然后将其分装到为0.5mL 薄壁PCR管中，每份100μL 。
8 将试管放入热循环仪中，按下列程序进行25 个扩增循环：
i. 94 ℃ 2min
ii. 94℃ 45s
iii. 50℃ 45s
iv. 72℃ 60s
v 再次重复ii~iv, 24 个循环。
vi. 72 °C 5min
vii. 4 °C 保存
viii. 结束
9 同时，用TAE 缓冲液制备一块1 ％的琼脂糖凝胶 。
10. PCR 反应结束后，将5μLPCR 产物与1μL 6X Ficoll Orange G 上样缓冲液混合后上样通过电泳分析PCR 产物。Orange G 染料位于电泳的前沿而不会在电泳时遮盖任何条带。
11. 将步骤10 剩余的DNA 扩增产物转移至一个新的1.5mL 微量离心管中，加入1/10体积的乙酸钠（3mo l/L, pH 5.2) 和2.5 倍体积的无水乙醇，涡旋混匀，在－20°C 或者更低的温度下放置30min 以上，使PCR 产物沉淀。4°C 最大转速离心30min, 弃去上清。
12. 用1mL 70％乙醇洗沉淀以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min, 最大可能地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
13. 将DNA 沉淀溶解于50μL 水。
制备dsRNA
14. 将T7RNA 聚合酶置于冰上放置，其他试剂室温放置。室温下，按下列配方在1.5mL微量离心管中配制一个100μL 的体外转录体系：
| 无核酸酶水 | 56.5μL |
| T7 转录缓冲液 |
10μL |
| PCR 模板DNA | 5μL |
| ATP ( 100mmol/L） | 5μL |
| CTP |
5μL |
| UTP ( 100mmol/L） | 5μL |
| GTP （100mmol/L） | 8μL |
| OTT |
0.5μL |
| T7RNA 聚合酶 | 5μL |
如果实验需要更多的RNA, 等比例扩大反应体系。
15 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂离心至试管底部。
16 37°C 孵育2h 。
17 加入5μL （ 10U) 无RNA 酶的胰腺DNA 酶I
18 轻轻涡旋1 ~ 2s 使试剂甩至试管底部。
19 37°C 孵育30min 。
20 加入等体积的酚：氯仿( 1 : 1, VIV) ，涡旋20s 。4°C 最大转速离心15min, 分离固相、液相，将液相层转移至一个新的1.5mL 微量离心管中。
21 向液相中加入1/10 体积的乙酸钠
22 弃去上清。加入1mL 70％乙醇洗涤沉淀，以去除残留的盐类。4 °C 最大转速离心5min 使RNA 沉淀，最大限度地弃去上清(70％乙醇），然后将离心管开盖放置数分钟使乙醇挥发。
23 将RNA 沉淀溶解于100 μL 的无核酸酶水中。利用吸收光分光光度计测量RNA 的浓度。
24 使两条链复性， 生成0.5μmol/L 的dsRNA 溶液：
| 正义RNA | 50pmol |
| 反义RNA | 50pmol |
| 复性缓冲液 | 10 μL |
| 无核酶水 | 加至100 μL |
25 将试管放在热循环仪中， 95°C 1min, 关闭热源使温度缓慢降至室温。
26 按照步骤21 、步骤22 的方法沉淀RNA 。
27 将沉淀溶于水中，制成lμg/μL 的储备液，－8 0 °C 保存。
检查dsRNA 的完整性
28 用0.5 X TBE 缓冲液配制一块1％的琼脂糖凝胶。
29 将dsRNA （步骤27 中得到的）和ssRNA （步骤23 中得到的有义链和反义链，作为对照使用）溶解于1 X 非变性凝胶上样缓冲液中，终浓度为0.1 μg/μL 。
30 每个样品上样5μL, 在0.5 X TBE 缓冲液中进行电泳，恒压75V 。
31 电泳结束后， 室温下用SYBR Gold ( 1 : 10000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液） 或者溴化乙锭( 1 : 20000 溶解于0.5 X TBE 缓冲液）染色10 min, 在紫外光下观察RNA 条带。
疑难解答
问题（步骤23) ： 没有检测到转录产物。
解决方案： 更换连接到引物上的T7 启动子（步骤5 ) 。
检查体外转录使用的试剂（步骤14 ) ； 确认所有的试剂都已添加，并且T7 聚合酶有活性。使用新鲜的NTP 和DTT 进行体外转录反应。
问题（步骤31) ： 发现污染条带或与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带。
解决方案： 凝胶中有污染条带表明由于RNA 酶的污染导致RNA 降解。要求实验全程都要戴手套，并且要经常更换。使用无RNA 酶的试剂、试管和移液器吸头。使用RNA 凝胶电泳专用的TBE 缓冲液和电泳装置。与PCR 产物（步骤10 ) 同样大小的条带表明DNA酶Ⅰ 失活。对于仍然含有带有模板DNA （步骤23 中） 的体外转录RNA （步骤16 ) 或纯化后的RNA 要用不同批次DNA 酶Ⅰ（来自步骤17 ～ 步骤19 ) 处理，并重复纯化和复性过程（步骤20 ～步骤27 ) ，然后再进行电泳检测dsRNA （步骤28～步骤31 ) 。
配方
复性缓冲液
| 试剂 | 数量（ 以100 mL 计） | 终浓度 |
| 乙酸钾( 2mol/L） | 50mL | 1mol/L |
| HEPES －氢氧化钾 |
30mL | 300mmol/L |
| 乙酸镁（1mol/L ） | 2mL | 20mmol/L |
| 水 | 补足100mL | |
| 室温保存。 |
Ficoll-Orange G 上样缓冲液
| 试剂 | 数量（以100mL 计） | 终浓度 |
| Ficoll-400 | 15g | 15% ( m/V) |
| Orange G | 250mg | 0 25% (m/ V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为1mL, -20 ℃保存。 |
非变性凝胶上样缓冲液
| 试剂 | 数量（以100 mL 计） | 终浓度 |
| Ficoll-400 | 15g | 15% ( m/V) |
| 二甲苯蓝 | 250mg | 0 25% ( m/V) |
| 溴酚蓝 | 250mg | 0.25% (m/ V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为1mL , -20℃ 保存。 |
PCR 缓冲液
| 试剂 | 数量（以100mL 计） | 终浓度 |
| Tris-HCI | 10mL | 100mmol/L |
| KCI | 25mL | 500mmol/L |
| MgCl2 | 1.5mL | 15mmol/L |
| 明胶 | 5mL | 0.1% (m/V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为lmL , -20℃ 保存。 |
T7 转录缓冲液
| 试剂 | 数量（以100mL 计） | 终浓度 |
| Tris-HCI | 40mL | 400mmol/L |
| 亚精胺 | 2.5mL | 25mmol/L |
| MgCl2 | 26mL | 260mmol/L |
| Triton X-100 | 1mL | 0.1 % (m/V) |
| 水 | 补足100mL | |
| 分装为1mL， －20℃ 保存。 |
请问T7加启动子的目的是什么
T7就是一种启动子系统。T7 启动子是转录起始位点+1
请问怎么知道mRNA的靶区域在哪？还有就是只要在靶区域的片段用BLAST显示的是特异性的就可以随便取吗？
在体外转录法制备dsRNA（双链RNA）的过程中，确定mRNA的靶区域是关键的一步。以下是一些常用的方法和步骤，以帮助确定mRNA的靶区域：
1. 目标基因的选择
首先，确定你想要抑制或研究的目标基因。你需要有这个基因的完整序列信息（通常从基因数据库中获得，如NCBI）。
2. 设计siRNA或shRNA序列
设计小干扰RNA（siRNA）或小发夹RNA（shRNA）的序列，这些序列将与目标mRNA的特定区域互补。设计时需要考虑以下几点：
靶区域的长度：通常选择21-23个核苷酸长的靶序列。
避免高度保守区域：选择特异性较高的区域，避免选择高度保守的序列，以减少脱靶效应。
避免二级结构：靶区域应尽量避免复杂的二级结构（如发夹结构），以确保dsRNA能够有效结合。
区域选择：一般选择目标mRNA的编码区（CDS）或3’非翻译区（3’UTR）作为靶区域。
3. 靶序列的筛选
使用生物信息学工具对靶序列进行筛选和优化：
BLAST比对：使用BLAST工具比对选择的序列，确保其特异性，即与非目标基因的相似性较低。
RNA二级结构预测：使用RNA结构预测软件（如RNAfold）预测所选靶序列的二级结构，确保其具有良好的结合特性。
4. 合成引物
根据设计的靶序列，合成适合体外转录的引物。通常，这些引物包括T7或其他RNA聚合酶启动子的序列，以便后续的体外转录。
5. 体外转录
利用合成的引物和模板进行体外转录，生成dsRNA。使用T7 RNA聚合酶或其他适合的RNA聚合酶进行体外转录反应。
6. 验证dsRNA的有效性
将制备好的dsRNA导入细胞或体内系统，验证其对目标基因mRNA的沉默效果：
qRT-PCR：检测目标mRNA的表达水平，确认dsRNA是否有效降低了目标基因的mRNA水平。
Western blot：检测目标蛋白的表达水平，确认dsRNA是否有效降低了目标基因的蛋白水平。
实际操作中常用的工具和软件：
BLAST：核酸序列比对工具，帮助确定靶序列的特异性。
RNAfold：RNA二级结构预测工具，帮助评估靶序列的二级结构。
Primer设计软件：设计适合的引物序列。
通过上述步骤和方法，你可以确定并验证mRNA的靶区域，从而成功制备有效的dsRNA。
请问预测完二级结构后怎么判断这一段可不可以用来做靶序列？如果无法避免二级结构这部分，有没有什么方法可以提供合成的dsRNA的质量？
在预测完RNA的二级结构后，可以通过以下几个方面来判断该序列是否适合作为靶序列：
靶序列的二级结构：
无明显的发夹结构：对于siRNA和shRNA来说，目标序列不应形成稳定的发夹结构，因为这可能会影响其与靶mRNA的结合。
开放区域：优先选择在RNA二级结构中较为开放的区域，这样更容易与靶mRNA结合。
能量评分：
使用RNA二级结构预测工具（如RNAfold）计算预测的自由能（ΔG）。较低的ΔG值表示更稳定的二级结构，不利于靶序列的可及性。
靶序列的位置：
通常选择位于mRNA编码区（ORF）或者3’非翻译区（3’UTR）中间部分的序列，因为这些区域通常是较为保守的，且二级结构较少。
提高合成dsRNA质量的方法
序列优化：
避免重复序列：重复序列可能会形成不希望的二级结构。
合理设计GC含量：过高或过低的GC含量都会影响二级结构的稳定性，通常40-60%的GC含量较为合适。
使用化学修饰：
2′-O-甲基修饰：这种修饰可以提高dsRNA的稳定性和特异性，减少脱靶效应。
磷酸酯骨架修饰：例如在两端进行磷酸酯修饰，可以提高dsRNA的稳定性和抗降解能力。
体外合成和质控：
体外转录和纯化：使用高质量的模板进行体外转录合成dsRNA，并通过纯化步骤去除反应中的杂质和未反应的成分。
测序验证：通过高通量测序验证合成的dsRNA序列，以确保没有错误和突变。
凝胶电泳分析：使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析合成的dsRNA的完整性和纯度。
功能验证：
体外细胞实验：将合成的dsRNA在细胞系中进行转染实验，验证其靶向效果和下调靶基因的效率。
qRT-PCR和Western Blot：通过qRT-PCR检测靶mRNA的表达水平，通过Western Blot检测靶蛋白的表达水平，确认dsRNA的有效性。
这些方法结合使用，可以显著提高合成dsRNA的质量和靶向效率，从而提高实验的成功率和数据的可靠性。