从革兰氏阴性菌（如E.coli）中分离DNA

从细菌中分离DNA 需要依赖SDS 和蛋白酶K 以裂解细胞。高分子质量的DNA 需要剪切（以减少它的黏性，更适合操作），用酚和氯仿提取，再用异丙醇提纯。该方案可以分离到长度为3 0 ~ 80kb 的DNA 。

试剂

乙酸铣( 5mol/L ）

细菌培养基(≥l.5mL)

培养基需要在剧烈振荡中过夜。

氯仿

乙醇(70%, 95%)

异丙醇

氯化钠( 5mol/L）

酚：氯仿( 1:1, V/V)

蛋白酶K （在TE 中20mg/mL , pH7.5)

核糖核酸酶A （ 在TE 中5mg/mL, pH8.0)

SDS (10%, m/ V)

TE(pH8.0) <A>

设备

可检测260nm 波长吸收的小杯

• 小杯可用一次性可穿透紫外线的丙烯酸甲酯材质或石英材质。石英杯在使用前和使用后要浸泡在盐酸：甲醇（1: 1, V/V) 中， 至少浸泡3 0min , 然后用无菌水充分冲洗。

针管， 26G

分光光度计

携带式真空吸气器

水浴锅， 预热到37°C

方法

1. 将过夜培养的l.5mL 细菌菌液转移到l.5mL 的微量离心管中。室温下离心30s 。用真空吸气器移去上清。
2. 加400μL TE(pH8.0) ，用涡旋器重悬细菌沉淀， 2 次， 每次20s 。
3. 加50μL 10%SDS , 50μL 蛋白酶K （ 在TE 中20mg/mL, pH7.5 )。在37 C 孵育细菌裂解液1h 。
4. 消化过的菌液很黏稠。用26G 针管剪切DNA, 尽可能减少泡沫。
5. 加500μL 1 : 1 混合好的酚：氯仿。
6. 盖上离心管管盖， 将两个液相温和混匀。
7. 将上层液相转移到一个新的微量离心管中， 重复步骤5 和步骤6 共2 ~ 3 次，直到界面接触处没有东西。
8. 用500μL 氯仿提取水相。
9. 将上清转移到一个新的微量离心管中， 加入约25μL 的5mol/LNaCl 和lmL 95 ％ 的乙醇。涡旋，在4°C 离心10min
10. 轻轻将上清倒出，然后用微量移液器将残余的乙醇吸出。将离心管开口在工作台放置约15min 。
11. 用l00μL 的TE ( pH8.0 ) 溶解已经干的细菌沉淀，加5μL 的RNase A （在TE 中5mg/mL, pH8.0 ) 。在37°C 孵育30min
12. 加40μL 的5mol/L 乙酸铁和250μL 的异丙醇。涡旋，在室温放置10min 。
13. 在室温离心10min , 收获DNA 。用70％的乙醇将沉淀洗涤2 次。在工作台中将离心管开盖晾干约15min 。
14. 用100μL 的TE （ pH8.0 ) 溶解沉淀。在260nm 测DNA 的浓度，将DNA 样本按1 : 10 稀释。空白对照为用水按1 : 10 稀释的TE ( pH8.0 ) 。1OD ₂₆₀≈50mg/mL 的DNA
15. 储存DNA 。

• DNA 可以在TE 缓冲液(10mol/L Tris, pH8.0 ,1mmo l/LEDTA) 中储存于-20℃或4℃，在－20℃ 和-80 °C 储存DNA 是没有差别的，但是DNA 储存在水中容易被水解。
• 长期储存DNA 的离心管应密封好，防止蒸发。