人胚胎肺成纤维细胞的培养

成纤维细胞作为体外最易培养成功的正常细胞，用途广泛。但由于其有限的传代寿命，通常用于细胞衰老的研究，在肿瘤研究中，常常作为正常细胞对照，用于研究细胞恶性转化的条件和影响因素。另外， 它也常用于药物毒性的检测。体外培养的成纤维细胞， 还用于疾病的诊断，如染色体异常疾病的筛选、先天性代谢遗传疾病的细胞化学及生物化学检验和鉴定。

（一）材料与设备

1.设备   超净工作台、离心机、CO₂培养箱、－10℃冰箱、－20°C冰箱。
2. 无菌材料   大培养皿、青霉素小瓶、50ml 离心管、刻度吸管、弯头吸管、T25 培养瓶、手术剪、刀、镊、细胞筛(100 目）、消毒用乙醇棉球、流产胚胎、高糖DMEM 培养液、胎牛血清、青／链霉素、D-Hanks 溶液、0.25％胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液。

（二）操作步骤

1.消化法

（1）流产胚胎引出后，于4℃保存并尽快运输至实验室。
（2）将胚胎置大平皿中，用酒精棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。
（3）持手术镊、剪，从胚胎腹部切口，向上扩，剪断肋骨，取出肺脏，去除外膜后，用D-Hanks 溶液（含双倍双抗）洗涤3~5 次，至组织呈灰白色。
（4）将组织剪碎至1mm³, 移入青霉素小瓶，加少星D-Hanks 溶液混匀，用弯头吸管将剪碎的组织移至50ml 离心管中加D-Hanks 溶液清洗，然后以每分钟1 000 转的速率离心6min 。
（5）弃上清，加入15ml 的0.25％胰蛋白酶／0.03%EDTA 消化液千室温下消化15min, 然后用吸管混匀，静置几秒钟，待组织块沉淀后弃去上清液。
（6）重新加入新鲜消化液15ml 消化10~15min, 混匀后将上清液（此时悬液中已含有消化下来的细胞）移入另一离心管中并用含20% 血清的DMEM 培养液终止消化，然后向原离心管中重新加入10~ 15ml 消化液消化，重复3~4 次。
（7）将消化后收集的细胞悬液混合，过细胞筛。
（8）筛后的细胞悬液移入离心管中，以每分钟1 000 转的速率离心6min, 弃去上清液，用含20％胎牛血清的DMEM 培养液混匀，此时可在计数板计数，然后将细胞悬液按每瓶6~8ml （含细胞量1 x 10⁶ 个）移入T25 培养瓶中，于37°C 、5% CO₂培养箱中培养。次日，观察细胞贴壁情况，弃旧液，用D-Hanks 溶液清洗后，换新鲜培养液千37℃ 、5% CO₂培养箱中继续培养。
（9） 原代培养的第三天，细胞长至80%~90% 汇合时，进行第一次传代。以后每3~4d 传代1次，按常规1 : 3 传代方法进行操作。

2. 组织块贴壁法

（1）流产胚胎引出后，于4℃保存并运输至实验室。
（2）将胚胎置大培养皿中，用乙醇棉球将胚胎进行整体擦拭消毒。
（3）待手术镊、剪， 从胚胎腹部切口，向上扩，剪断肋骨，取出肺脏，去除外膜后，用D-Hanks 溶液（含双倍双抗）洗涤3~5 次，至组织呈灰白色。
（4）将组织剪碎至1mm³, 移入青霉素小瓶，然后吸入D-Hanks 溶液清洗2~3 次。
（5） 将组织块移入T25 培养瓶，用弯头吸管将组织块轻轻剥离成单个，并均匀贴附在瓶壁，然后将贴附有组织块的培养瓶移入培养箱，翻转倒置4~6h, 至组织块贴牢。
（6）加入6~8ml 含20％胎牛血清的DMEM 培养液，于37℃ 、5% CO₂ 培养
箱中培养。
（7）3~7d 后于镜下观察，组织块周围会有细胞长出，细胞长多后就可看到“生长晕“。
（8） 原代培养过程中应保证每3d 换1 次培养液，细胞长至7~10d 时可进行第一次传代。以后每3~4d 传代1 次，按常规1 : 3 传代方法进行操作。

（三）小结

体外培养的皮肤成纤维细胞和包皮成纤维细胞最常用。前者可在门诊活检取材。注意要将脂肪组织、结缔组织去除干净。后者可利用手术切除组织。成纤维细胞体外培养，可传代20~50 次。细胞80%~90％汇合时就需传代。注意避免接触抑制和自发转化等。