通过转染双链siRNA 在果蝇S2 细胞中进行RNA 干扰

本方案介绍一种通过试剂向果蝇S2 细胞转运siRNA 以触发RNA 干扰的有效方法。本方案适用于24 孔板内培养的细胞。如果使用其他规格的多孔板、培养瓶或者培养皿，需要根据培养孔的表面积换算细胞密度和试剂用量（表1 ) 。

表1 果蝇细胞转染所用细胞， 转染试剂和siRNA （或者ASO) 的体积

培养板或培养皿	24孔	12孔	6孔	6cm	10cm
每孔表面积/cm2	2	4	10	20	60
Schneider ‘s 果蝇培养液＋ 10%FBS/mL	0.45	0.9	1.8	4.5	9
A 管
Schneider ‘ s 果蝇培养液/ μL 1μg/mL dsRNA, 10 μmol/L 双链siRNA 或12.5 μmol/L ASO/μL	24 1	48 2	96 4	240 10	480 20
B 管
Schneider ‘ s 果蝇培养液/ μL 转染试剂／μL	24 1	48 2	96 4	240 10	480 20
总体积/mL	0.5	1	2	5	10

试剂

转染试剂
果蝇Schneider 2 ( S2 ) 细胞
热灭活的胎牛血清( FBS )
Schneider ‘s 果蝇培养液
双链siRNA ( 10μmol/U )

设备

离心机
锥形离心管( 50mL )
免疫荧光、Western 印迹、定量RT-PCR 或者Northern 杂交用设备（步骤9 )
层流生物安全柜(II 级）
微量离心管( 1.5mL )
体视显微镜
组织培养皿( 10cm )
组织培养箱(25 °C) ，一定湿度
组织培养板(24 孔）

方法

转染用细胞的制备

1. 用含有10％胎牛血清的Schneider ‘s 果蝇培养液培养S2 细胞，细胞在2 5 °C 湿润的培养箱中生长至至少90％单层，密度达每孔8 X 10⁶ ~ 10 X 10⁶ 个细胞。
2. 在50mL 消毒锥形离心管中，用含有10％胎牛血清的Schneider’s 果蝇培养液（25 °C)将细胞稀释至2. 75 X 10⁵ 个/mL。
3. 向24 孔板每孔中加入450μL 细胞悬液(1.24 X 10⁵ 个细胞） 。在25 °C 湿润的培养箱中培养细胞。

准备转染溶液

所有的体积都是以单孔实验计算，但是，建议至少进行三次平行重复的实验。进行多孔转染时，额外增加10％的试剂以避免在分装时造成损失。

4. 在一个灭菌微量离心管中加入24μL 无血清Schneider’ s 果蝇培养液，然后向其中加入1μL (10pmol ) 双链siRNA ，轻轻颠倒混匀。
5.在另一个无菌微量离心管中加入24μL 无血清Schneider’s 果蝇培养液，然后向其中加入1μL转染试剂，轻轻颠倒混匀。
6. 将两种混合液在室温下孵育5min 。将siRNA 混合液缓慢加入转染试剂混合液中，轻轻颠倒混匀，室温下静置20min, 使之形成siRNA－脂质体复合物。

转染和基因敲减分析

7. 将50μL siRNA-脂质体转染溶液加入每个孔稀释过的（步骤3) 细胞中。轻轻地前后直线移动培养板使之混匀。不要旋转培养板，以免使中间的细胞脱落，降低转染效率。
8. 将细胞置于25 °C 湿润培养箱中培养2 ~ 6 天。
9 对基因敲减效果的分析：通过免疫荧光和Western 印迹法，利用特异性识别目标蛋白的抗体检测目标蛋白的减少量，以及通过定量RT-PCR 或者Northern 杂交检测目标mRNA 的减少量。

问题解答

问题（步骤9) ： 没有实现基因沉默。

解决方案： 双链siRNA 可能发生降解。重新制备双链siRNA 并转染。

问题（步骤9): siRNA 的沉默效率不如预期的高。

解决方案： 本方案中使用的双链siRNA 的浓度为20mnol/L 。在1 ~ 100mnol/L 优化双链siRNA 的浓度。
靶向同一基因的不同siRNA 的沉默效率会不同。应该对既定mRNA 的几条不同双链siRNA 进行比较。

问题： 蛋白质表达降低量小于90% 。

解决方案： 返回步骤1 ， 制备新鲜的双链siRNA 并对同一细胞进行第二次转染。