慢病毒载体的滴定

一、试剂

完全培养基、DMEM 培养基、胎牛血清（FBS)、慢病毒载体储备液、多聚甲酸( 4%) （ 可选；见步骤15)、青霉素／慢病毒滴定试剂盒链霉素溶液( P/S ) （100 ×)、磷酸盐缓冲盐水( PBS )、聚凝胺（海美溴铵） ( 8mg/mL) 、QuickTiter （慢病毒相关的HIV p24 )、293T 细胞、胰蛋白酶－EDTA ( 0.05% )、UltraRapid 慢病毒滴度测定试剂盒（可选；见步骤23 )

二、设备

12 孔培养板、流式细胞仪、血细胞计数器、恒湿细胞培养箱（37℃, 5%CO²)、配备观察荧光蛋白滤光片的倒置荧光显微镜、微量移液器、可读450nm 的微孔板酶标仪、带有无菌滤芯的移液器吸头(20μL 、200μL 和1000μL)、无菌试管（1.5mL)

有限稀释法测定病毒滴度

该方案仅适用于293T 细胞功能启动子下表达绿色荧光蛋白的慢病毒。

1 滴定实验前1 天，向12 孔板上含lmL 完全培养基的每孔中接种3 X 10⁵个293T 细胞。轻轻来回晃动倾斜平板确保细胞均匀分布。一块板上只能有一种慢病毒载体储备液。37 °C 、5% CO²细胞培养箱中培养过夜。

2 第1 天，用0.5 mL 37°C 预热的、含8 μg/mL 聚凝胺（1 : 1000 稀释8mg/mL 的聚凝胺储备液）的完全培养基更换孔中的完全培养基。

3 用完全培养基连续稀释慢病毒载体：对于非浓缩储备液，进行1 : 10 、1 :10²和1 :10³稀释；对于浓缩储备液，进行1 : 10² 、1 : 10³ 、1 :10⁴和1 : 1 矿稀释。每孔加5μL载体稀释液，重复3 次（每个稀释度3 孔） 。对于非浓缩储备液，还包括一组5μL 原液孔。37 °C 培养箱进行培养。

4 第2 天， 加入37 °C 预热的0.5mL 完全培养基。在细胞培养箱中培养2 天。

5 第4 天，小心地移除每孔中的完全培养基，加入lmL PBS 。

6 使用配备观察绿色荧光蛋白滤光片的倒置荧光显微镜，在10 倍物镜下计数每个视野的克隆数目。选择在每个视野中有1 ~2 0 个克隆的稀释度。该稀释度每孔随机计数5 个视野(3 孔X5 视野／孔＝ 15 个观察视野）计数。计算出平均克隆数／观察视野后，根据如下公式计算滴度
   滴度(TU/mL) = (N× C× D) /0.005
式中， N 为平均克隆数／观察视野； C 为孔面积除以视野面积； D 为载体储备液的稀释倍数。
先确定观察视野的直径(FOV_ϴ) ，即目镜的视野数（该数值一般写在目镜一侧，例如， 22对应22mm ) 除以物镜放大倍数（如10) ，然后使用公式，面积＝  π × (FOV_ϴ/2)²  计算观察视野面积。

流式细胞仪测定滴度

7 准备滴定用293 T 细胞，具体见步骤1 。在12 孔板上除了准备必要数目的孔，还要再增加3 个孔。

8 第1 天，对3 个孔进行细胞计数。弃去完全培养基，用1mL PBS 洗涤细胞，加入0.5mL 0.05 ％胰蛋白酶－EDTA, 室温下孵育5min 。加0.5 mL 完全培养基充分混匀细胞后转移细胞悬液到1.5mL 试管中，利用血细胞计数器确定细胞浓度。计算出每孔细胞的平均数。

9. 按照步骤2~4 进行滴定。

10 在第4 天，弃去完全培养基，用1mL PBS 洗涤细胞，加入0 . 5mL 0.05％胰蛋白酶-EDTA, 并在室温下孵育5min 。

11 每孔加0.5mL 完全培养基充分混匀细胞，转移细胞悬液至1 .5 mL 试管中。

12 室温下以500g 离心细胞5 min 。吸弃完全培养基后用1mLPBS 重悬细胞。

13 再次在室温下以500g 离心细胞5min 。弃去完全培养基，用1 ~2mL PBS 重悬细胞。

14 使用流式细胞仪确定荧光阳性细胞的百分比。
如果1h 内不进行分析， 用4％多聚甲醒－PBS 固定细胞30min, 再用PBS 洗涤，在PBS 中4 ℃ 储存。

15 根据如下公式计算滴度(TU/mL)
滴度(TU/mL) = (N× F× D ) /0.005

式中， N 为第1 天每孔细胞平均数； F 是荧光细胞的百分比； D 为载体储备液的稀释倍数。

对转导细胞基因组DNA 上的载体基因组进行PCR 定量以测定滴度

16 . 按步骤1 ~4 进行。

17 第4 天，弃宪全培养基，每孔用1mL 的PBS 洗涤细胞，每孔加入0 .5mL 的0.05 %胰蛋白酶－EDTA, 室温孵育5min 。

18 . 每孔加0.5mL 完全培养基，重悬细胞。将细胞悬液转移至1.5mL 试管中。

19 在室温下以500g 离心细胞5min 。弃培养基，用1mL 的PBS 重悬细胞。

20 在室温下再次500g 离心细胞5min 。

21. 用商业化试剂盒从转导细胞分离基因组DNA, 测定基因组DNA 浓度。

22 利用定量PCR 确定每个靶细胞二倍体基因组上慢病毒载体的拷贝数( Kutner et al.2009) ，也可以按照使用说明书（省略步骤18 ~ 24) ，使用基于定量PCR 的UltraRapid 慢病毒滴定试剂盒。

23 根据如下公式计算慢病毒载体滴度
滴度(TU/mL) = (N × C× D) /0.005
式中， N 是第1 天每孔细胞平均数； C 是每个二倍体基因组中慢病毒载体拷贝数； D 为载体储备液的稀释倍数。

ELISA 测定p24 浓度从而确定滴度

另一种基于转导试验的方法是利用ELISA 测定慢病毒载体储备液中HIV-1 p24 的浓度。

24. 对于非浓缩慢病毒载体储备液，利用OptiMEM 进行1 : 10 和1 :10²稀释，每个稀释度重复测定3 次。对于浓缩慢病毒载体储备液，利用OptiMEM 进行1 :10²、1 :10³和1 : 10⁴ 稀释，每个稀释度重复测定3 次。

25 按照使用说明书，使用QuickTiter 慢病毒滴定ELISA 试剂盒测定慢病毒载体储备液中病毒颗粒上p24 的浓度。