应用长链dsRNA 抑制基因表达

在植物以及大多数真菌、非哺乳动物及其细胞系中，应用外源性长链dsRNA或者表达长反向重复RNA 转录物能够诱发细胞内相应mRNA 的降解$Fireetal1998;KennerdellandCarthew1998;MisquittaandPaterson1999$ 。哺乳动物卵母细胞和dsRNA 诱导干扰素反应缺失的哺乳动物细胞系中，长链dsRNA 和反向重复RNA 转录物也能够诱发RNA 干扰。dsRNA 诱导的干扰素反应是一种天然免疫反应。长度超过30bp 的dsRNA 能够激活2 ‘, 5’－寡腺昔酸合成酶和蛋白激酶R , 它们能激活RNase L 并使真核起始因子2 的α亚基$eIF2-\alpha ）\mathrm{失}\mathrm{活}(Minksetal.1979;Mancheetal.1992$ 。干扰素反应诱导mRNA 的非特异性降解和广泛抑制蛋白质合成，最终诱发细胞凋亡。因此，使用长链dsRNA对特定基因进行抑制性研究已不再可能。

长链dsRNA 的设计

一般来讲， 500~800bp 长度的dsRNA 分子可用于靶向外显子，尤其是编码序列$CDS$ $Hannon2003$ 。据报道，如果目标mRNA 与另一条mRNA 的同源序列长度超过19bp ,目标mRNA 的表达就能被有效抑制$Kulkarnietal.2006$ 。因此，利用dsCheck 、E-RNAi 、BLAST 或者类似的计算手段寻找dsRNA 的有义链或反义链与细胞内mRNA之间的同源性是该技术的关键点。此外，还要注意靶向同一条mRNA 的dsRNA 的其他区域引起的RNA 干扰效应。

 

长链dsRNA 的体外合成

利用来自噬菌体的RNA 聚合酶如T7 、SP6 和T3 等进行体外合成是制备RNA 干扰实验所用长链dsRNA 的一种简便而快速的办法 。应用体外转录反应制备单独的有义链或反义链也是值得推荐的方法，尤其是在制备富含GC 的dsRNA 时。应用这种方法可以在将有义链和反义链进行复性之前分别对其质量进行评估。此外，还可以采取将正义模板和反义模板混合在一个体外转录体系内，或者利用两种反向的RNA 聚合酶启动子对同一条模板进行转录的方法制备dsRNA 。

• 质粒模板。有两种方法可以制备质粒模板。一种方法是：选定dsRNA，将与其有义链或反义链对应的DNA 片段克隆至带有噬菌体RNA 聚合酶启动子质粒的多克隆位点。另一种方法是：将DNA 片段克隆至质粒，使其位于一对反向的噬菌体RNA 聚合酶启动子中间。这两种方式中，在体外转录之前都需要利用限制性内切核酸酶在插入片段的两端将插入的DNA 片段线性化，以确保相应转录物RNA 的长度。
• PCR 模板。T7 、SP6 或T3 噬菌体启动子长度较小，仅19bp, 这使得它们能够被连接在正向或者反向PCR 引物的5 端。利用一条连接启动子的正向引物和一条未连接启动子的反向引物，可以通过PCR 反应对正义或者反义模板进行体外转录扩增 。也可以利用一对融合了启动子的PCR 引物同时对同一条模板进行扩增。从体外转录的RNA 得率来看， PCR 模板要优于质粒模板，这是因为前者可以在不增加反应体系中DNA 总量的清况下提高模板的摩尔浓度。

反向重复dsRNA 的内源性

表达为了进行体内应用，可以构建表达长链发夹状RNA 的表达体，方法是装配正义和反义序列，并利用间隔区将它们隔开，以产生反向重复序列（ Lee and Carthew 2003 ) 。克隆反向重复序列具有挑战性，但使用内含子作为间隔区能够提高构建体在细菌体内的稳定性，从而使克隆更容易实现。长链发夹状dsRNA 的内源性表达可以通过RNA 聚合酶II 启动子（如CMV) 或者二元表达系统（ 如GAL4/UAS ) 在特定细胞系或者转基因动物体内引起待续、可诱导和组织特异性的基因沉默。这一方法的主要不足在于反向重复序列的构建比较耗时。