碱－SDS 质粒小量制备

小量制备可以从细菌培养物中抽提和分析，离心机12 或16 管足够一次制备。

一、材料

• 5 ml 过夜培养细菌培养物。使用LB培养基加入合适的抗生素培养单克隆菌体，37’C 振荡培养
• 灭菌的微桩离心管
• 冰
• 溶液I （裂解缓冲液， 25 mmol/L Tr的HCI pH8.0, 50 mmol/L葡萄糖， 10 mmol/LEDTA) ，冰上预冷
• 溶液II （变性缓冲液， 0.2 N NaOH, 1.0 % SOS) ，现配现用，室温保存
• 溶液III （复性缓冲液， 5 mol/L KAc 。制备方法：配制120 ml KAc 再加入23 ml 冰醋酸和57 ml 水，总体积为200 ml ) 冰上预冷
• TE
• 70% 和100% 乙醇
• RNase A （无DNase) ，配成2 mg/ml 溶液，分装并保存于－ 20’C 。可以按程序制备RNase A （无DNase) ，也可以直接购买

二、步骤

1. 加入1.5 ml 培养物于离心管中。
2. 10000 g 离心2 min, 低温离心更佳，弃尽上清。
3. 将菌体重悬于100 μl 预冷的溶液I, 振荡2 min 。
4. 将离心管于室温下放置5min, 细菌将会裂解而释放DNA。
5. 加入200 μI 溶液II上下颠倒离心管5s以混合，振荡会损伤DNA 。
6. 冰浴5 min 。
7. 加入溶液III并颠倒离心管20 s以混匀。
8. 冰浴5 min, 质粒DNA 将被选择性的复性。
9. 12000g 离心5 min 。
10. 用移液头将上清转移至另一个离心管。
11. 加入5μI 2 mg/ml RNase A （无DNase), 37℃温育5min 。
12. 加入450 μI 酚－氯仿抽提RNase A 和蛋白质。
13. 用氯仿抽提。
14. 加入1 ml 预冷的乙醇并于－80’C 沉淀20 min 。
15. 吸去或倒掉上清。
16. 用70% 乙醇洗涤沉淀，离心1 min, 吸去上清。
17. 于真空中干燥5 min，也可将离心管倒置于纸巾上吸干并干燥30 min 。
18. 用25 μI TE 重悬沉淀，取2~4 μl 电泳检测并将余下DNA 于-20’C 保存。