TUNEL分析

TUNEL方法（末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-地高辛配基切口标记）源自完整固定的细胞核DNA 裂解部位标记（如Gavrieli et al. 1992)。 该法可用于组织切片、玻片上细胞生长、流式细胞计量术分析，用于组织切片的改进程序由Naik 及其合作者提出(Naik et al. 1996) ，叙述如下

1、组织切片的TUNEL 染色

1）取下组织，立即用新制备的4％甲醛固定，室温过夜。用多聚甲醛(EM 级）制备4％的甲醛溶液，在100 ml 水中加8g 多聚甲醛，在通风橱中加热至50 ~ 60℃．加几滴1 moL/L NaOH 使固体全部溶解。 多聚甲醛全部溶解后，将溶液放冰上，迅速冷却至室温。加100 ml 2 的2 x PBS, 过滤固定液。甲醛储存液应在每次实验前新配。

2) 通过50% 、70%、80% 、95% 、100％乙醇和100% 二甲苯系列孵育（每步5 分钟）使组织脱水

3) 用石蜡包埋组织，制备5μm厚的切片，固定于玻片上，将石蜡切片70℃加热10分钟或58 ~ 60℃加热30 分钟去除石蜡

4) 通过以下溶液进行系列转移水合切片：二甲苯5 分钟2 次， 96％乙醇3 分钟2 次，然后90% 、80% 、70% 、50 ％，双蒸水各3 分钟

5) 在冷的4％甲醛中后续固定切片5 分钟，用pH7.2 的PBS 清洗3 次，每次5 分钟

6) 室温下用1 ~ 2 μg/ml 蛋白酶K 的10mmol/L Tris-HCI 溶液(pH8.0) 处理玻片10 分钟，用PBS 清洗3 次

7) 用0.5%H₂O₂的PBS 溶液室温处理20 分钟，封闭内源过氧化物酶活性。

8) 用补充有150 mmol/L NaCl 和0.05% BSA 的TdT 反应缓冲液(GIBCO/BRL）预孵育切片。每个切片上加27 μl 溶液，用已裁成合适大小的Parafilm 膜覆盖。

5x TdT 反应缓冲液

500 mmol/L 二甲胂酸钾， pH7.2

l0 mmol/L CoCl₂

l mmol/L DTT

9) 室温孵育10 分钟后，取下Parafilm 膜，用纸巾吸去水。

I0) 在用TdT 反应缓冲液制备的200 U/ml TdT 酶(GIBCO/BRL; 15 U/ml), 2 – 4 μmol／L地高辛配基偶联的dUTP 中孵育切片，再用Parafilm 膜覆盖切片， 37℃ 湿室中30 分钟～ 1 小时。用pH7.2 的PBS 将切片洗3 次。

11) 用5 U/ml 辣根过氧化物酶偶联的抗地高辛孵育玻片，用Parafilm 膜覆盖。37℃ 温室中孵育30 分钟

l2) 应用快速DAB 底物(Sigma) ，用DAB 和H₂O₂ 处理检测标记细胞。用过量水清洗切片。可用甲基绿复染切片30 秒。用过量水清洗。

13) 通过用二甲苯终洗2 次的系列乙醇使切片脱水。 用Permount 或Entallan介质固定，用光学显微镜分析

注意事项

TUNEL 阳性核被染成深棕色。如需要，在DAB 反应中可加人硫酸镍(3 mg/ml) 。可以增强染色，阳性核将呈现紫／黑色。

2. TUNEL 染色的流式细胞计量术分析

1) 凋亡诱导之后， 200 g 离心5 分钟收集1×10⁶ 悬浮细胞，用冷的PBS 洗2次，重复离心

2) 用2 ml 2 ％的甲醛PBS 溶液(pH7.2，用多聚甲醛新配）固定细胞沉淀，室温下在水平摇床上孵育30 分钟。

3) 200 g 离心5 分钟沉淀细胞，用PBS 洗1 次。重复离心。

4) 用500 μl 0.1 % Triton X-100, 0.1 ％柠檬酸钠溶液4℃ 孵育2 分钟透化细胞，用PBS 洗2次。

5) 在温室中于TdT 缓冲液(30 mmol/L Tris-HCl, pH7.2 ,140 mmol/L 二钾胂酸钠）中用0. 3 nmol/LFITC-12-dUTP (Boehringer Mannheim) 、3 nmol/L dATP, 25 mmol/L CoCl₂、25 U TdT (Boehringer Mannheim) 37℃孵育1 小时，进行TUNEL 反应，终体积50 μl

6) 37℃孵育1 小时后，加人2μl 0.5 mol/L EDTA 终止反应，用pH7.2 的PBS 将细胞洗2次。用带有氩激光(488 run) 的流式细胞计量仪(FACScan, Becton Dickinson) 分析数据。或者，可将细胞重悬于50μl 液体固定介质如FluoroGuard (Bio-Rad) 中，移到载玻片上，盖上盖玻片、用荧光显微镜分析。

注意事项

FACSsean 对TUNEL 标记的定量分析最好用于淋巴细胞，对贴壁细胞如成纤维细胞效果不够好

3. 贴壁细胞的TUNEL 染色

1) 用无菌镊子将一无菌盖玻片放入35 mm 培养皿中

2) 将大约1×10⁴ 细胞接种于无菌盖玻片上，培养24 ~ 48 小时。凋亡诱导时，细胞铺满不超过80% ，如细胞贴壁不太好，可以用纤连蛋自、聚赖氨酸或血清预处理盖玻片，以使细胞更好地贴壁生长

3) 诱导凋亡后，用pH7.2 的PBS 轻轻洗细胞1 次，不要除去垂死细胞，用冰冷的甲醇（- 20℃） 固定10 分钟

4) 室温空气干燥玻片5 分钟，在pH7.2 的PBS 中温育10 分钟重新水合

5) 按上述方法进行TUNEL 反应。将合适的Parafilm 膜放入温室，膜上加50μl TdT反应混合液，放盖玻片，细胞朝下在反应液上。37℃ 孵育1 小时

6) 从温室中取出盖玻片，放回35 mm 培养皿中。用PBS 洗细胞3 次，用固定液(Bio-Rad) 固定到载玻片上