JAM分析

此分析方法基于用[³H] －胸腺嘧啶脱氧核苷标记核DNA, 用玻璃纤维滤器获得样品。 凋亡产生的DNA 片段小到可以通过玻璃纤维滤器，因此特定样品的放射活性减少。很显然，这种分析对循环的细胞是必需的。

• 实验前一天，将细胞接种于新鲜培养基。对数生长期细胞可更好地掺入[³H]－胸腺嘧啶脱氧核苷。
• 收获细胞，在新鲜培养基中以1×10⁶细胞／ml重悬，用5 μCi/ml [³H]－胸腺嘧啶脱氧核苷标记2~4 小时。或者，用1 μCi/ml [³H]－胸腺嘧啶脱氧核苷过夜标记较低密度的细胞。
• 用HBSS, PBS 或培养基将细胞洗2次，在培养基中重悬0.2×10⁶-1×10⁶细胞／ml，在开始前确定细胞已被标记。
• 接种细胞于96 孔平底组织培养板，用推定的凋亡诱导物孵育5 ~ 18 小时。

应在—块板的不同位置（如使用多块板，则每块板的不同位置）设置非处理的对照。培育时间依细胞类型确定，较长的培育时间通常可测定更大量的DNA 片段，但也会使本底增加。

• 加EDTA 至终浓度为5 mmol/L, 用合适的96 孔板细胞收获仪将细胞收获至玻璃纤维滤器

培养板可直接收获或在－20℃冷冻几天，可用Parafilm 膜密封培养板防止蒸发，收获之前，室温融解培养板。此过程中，将细胞从培养板中冲洗至滤器上，被去离子水裂解。完整的核DNA将结合在玻璃纤维滤器上，而小片段将流过

• 在80℃烘箱中10分钟或微波4 分钟干燥滤器。
• 在塑料袋中密封滤器，加人可生物降解的闪烁液至滤器完全浸湿，用β计数仪测定放射活性
• 按下式计算DNA 片段含量：

DNA 片段(%) = 100% x [ 1-（试验值／对照值）］

注意事项

1. 试验应作3 次，因为可能观察到由于细胞类型引起的差别。通常板边缘的孔会产生最大的标准差。通常第5 步不需加EDTA, 但加入会减少数值波动。
2. 如[³H] －胸腺嘧啶脱氧核苷对所用细胞系DNA 标记效率不清楚，建议进行预实验，对细胞作不同密度不同时间的标记处理。在分析中，使用标记良好的细胞波动较低（如大于15 000 cpm/20 000 细胞）。
3. 也可用这一方法测定细胞介导的细胞毒性或细胞毒性T淋巴细胞介导的细胞杀伤。在开始CTL 分析前只标记靶细胞。干滤器可在室温长时间存放。重要的是要记住JAM 分析不适用于静止细胞或DNA 只切割成高分子量片段的细胞