英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
DNA胶用来分离、确定或者纯化DNA片段。用于DNA测序反应的测序胶不在这儿讨论。每位实验室成员有不同的制胶方法。
样品准备
- 6 X 上样缓冲液： 30% (V/V) 甘油， 0.25%(W/V) 溴酚蓝， 0.25% (W/V) 二甲苯腈蓝，蒸馏水配制。贮于－20’C 。
- 样品缓冲液与DNA在60’C 温育5 分钟。
标准分子／分子质量标记
- 琼脂糖凝胶中，指示剂溴酚蓝与分子质量大约600bp的DNA分子一起迁移，而二甲苯腈蓝则与大约4000bp的DNA分子共迁移。确切的迁移与琼脂糖的质量与浓度有关。
- 溴酚蓝与二甲苯腈蓝也可以用做聚丙烯酰胺凝胶中DNA的指示染料。
- 市场上有无数的DNA标准分子质量标记。其中大多数是已知DNA酶切产生的片段组合。这些标准DNA标记产生不同大小的片段，使人更容易快速估计未知片段的大小，也提供了胶与胶之间差异的参照。也可以自己制备标准，但是通常太麻烦，不值得这么做。
表1指示剂染料的迁移
| 聚丙烯酰胺（％） | 溴酚蓝a | 二甲苯腈蓝a | |
| 聚丙烯酰胺凝胶 | |||
| 3.5 | 100 | 460 | |
| 5.0 | 65 | 260 | |
| 8.0 | 45 | 160 | |
| 12.0 | 20 | 70 | |
| 20.0 | 12 | 45 | |
| 变性聚丙烯酰胺凝胶 | |||
| 5.0 | 35 | 130 | |
| 6.0 | 26 | 106 | |
| 8.0 | 19 | 70-80 | |
| 10.0 | 12 | 55 | |
| 20.0 | 8 | 28 |
a 数值表示与染料共迁移的DNA 片段的大致长度（核昔酸对）
- 分子标尺是DNA梯子，各大小片段间有一定的间距。最适用于精确测定样品DNA的分子质量。大多数包含有明显可见的参考条带。
- 保留一份最常用的DNA 标准分子标记。两组有用的DNA 标准标记分别为(bp): λ／ Hind Ⅲ： 23, 130, 9416, 6557, 4361, 2322, 2027, 564, 125
ФX174/ Hae Ⅲ: 1353, 1078, 872, 603, 310, 281, 271, 234, 194, 118, 72
样式
- 中型胶盒vs 小型胶盒。小型胶用于监测酶切进程或者查看质粒抽提的质量，这是DNA 胶的两种最大用途。小型胶相对中型胶的优势在于电泳结束的时间较快（不到1 小时，中型胶3~4 小时）以及所需DNA 较少。Southern 印迹在大一点的胶上做较好，因为信号可能较弱需要较多的DNA 。
- 制备型胶VS 分析型胶。分析型胶用来收集信息。在制备型胶上，感兴趣的DNA 将被取走。制备型胶通常比较大，可容纳大批的样品。一块制备型胶可能只在胶的上端有一个极大的孔。
分离试剂
- 琼脂糖或者聚丙烯酰胺：分离能力VS 分离范围！
- 琼脂糖（分离范围大）的使用已经标准化，适于分离200bp-50kb 分子，水平方式电泳。10000kb 的DNA 可采用脉冲电场凝胶电泳(PFGE) 。
- 用聚丙烯酰胺（分离能力好）来分离小的DNA 片段， 5bp-500bp, 通常制备成垂直式凝胶。碱性琼脂糖凝胶用来水解DNA 和分析单个DNA 链。使用碱性琼脂糖凝胶的原因通常是想查看cDNA 合成过程中第一步由逆转录合成的第一和第二条DNA 链的大小。往热的琼脂糖中加入碱液会水解琼脂糖，所以先以中性溶液制成胶，再在电泳前用新鲜配制的碱性电泳缓冲液平衡凝胶。
- 经化学修饰的低熔点琼脂糖在较低温度下融化(30’C 成胶， 65’C 融化） 。分辨力好于普通琼脂糖， 但不及聚丙烯酰胺。在冷库中跑电泳以防止琼脂糖凝胶的融解。低熔点琼脂糖很有用，因为有很多种方法从低熔点琼脂糖中回收DNA。
- 采用合适的琼脂糖浓度。见表2
表2 DNA 电泳所采用的胶浓度
| 种类 | 成分 | 分离范围 |
| A | 琼脂糖（％） | 线性DNA 分子的有效分离范围(kb) |
| 0. 3 | 60~5 | |
| 0 .6 | 20 ~1 | |
| 0.7 | 10~0.8 | |
| 0 .9 | 7 ~0.5 | |
| 1.2 | 6~ 0.4 | |
| 1.5 | 4~ 0.2 | |
| 2 .0 | 3~ 0.1 | |
| B | 丙烯酰胺（％ ） | 有效分离范围（ 核昔酸对） |
| 3. 5 | 100 ~ 1000 | |
| 5.0 | 80 ~ 500 | |
| 8 .0 | 60 ~ 400 | |
| 12 .0 | 40 ~ 200 | |
| 20.0 | 10 ~ 100 |
A 选择般能分开你要分析的D N A 大小的琼脂糖浓度。
B 如果你感兴趣的DNA 小于1kb, 可用聚丙烯酰胺凝胶。
缓冲液
- 制胶和实际电泳采用同种缓冲液。
- 如果用水代替缓冲液来配胶（这是最常犯的错误之一），胶上几乎没有电导， DNA就会移动得很慢或者根本不移动。这时候需要重新配胶。
- 最常用于DNA 的缓冲液是TAE (Tris－醋酸－ EDTA) 与TBE (Tris硼酸－EDTA),有时候也用TPE 。
- 用不同缓冲液来制胶、跑胶，结果有所不同。例如，双链线性DNA 片段在TAE 中比TBE 或者TPE 中迁移大约快15% ，而超螺旋DNA 的分辨率在TAE 中较好。
- 推荐使用TBE 。它具有最强的缓冲容量。
- 如果忘记在胶中加溴化乙锭，可以加到电泳缓冲液中。
表3 常用电泳缓冲液
| 缓冲液 | 工作溶液 | 高浓度贮液（每升） |
| Tris－乙酸(TAE) | l X: 0.04 mol/L Tris- 乙酸 0.001 mol/L EDTA |
50 X : 242 g Tris 碱 57.1 ml 冰乙酸 100 ml 0. 5 mol/L EDTA (pH 8.0) |
| Tris – 磷酸(TPE) | 1 x : 0. 09 mol/L Tris- 磷酸 0.002 mol/L EDTA |
10 X : 108 g Tris 碱 15 .5 ml 85 ％磷酸(1.679 g/ ml) 40 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8 .0) |
| Tris－硐酸a(TBE) | 0.5X: 0.045 mol/L Tris －绷酸 0.001 mol/L EDTA |
5 X: 54 g Tris 碱 27 .5 g 硐酸 20 ml 0.5mol/L EDTA (pH 8.0) |
| 碱b | 1 X : 50 mN NaOH 1 mmol/L EDTA |
1 x: 5 ml 10 N NaOH 2 ml 0.5 mol/L EDTA (pH 8.0) |
a 高浓度TBE 长时间储存会产生沉淀。为避免产生沉淀，储存5 X 溶液于玻璃瓶，室温， 丢弃任何有沉淀的批次。TBE 的琼脂糖凝胶电泳最初采用1 X 的工作强度（即1：5 稀释高浓度贮液），但是0.5 x 的工作溶液能提供足够的缓冲能力。现在几乎所有的琼脂糖凝胶电泳都以1:10 稀释贮液来进行。TBE 的聚丙稀酰胺凝胶电泳是用1 X 工作强度进行的，是通常琼脂糖凝胶电泳强度的两倍。用于聚丙稀酰胺电泳垂直槽的缓冲液的贮备液很小，而穿过其中的电流量很大。需要1 X TBE 来提供足够的缓冲能力。
b 碱性电泳缓冲液应该新鲜配制。
电源
- 电压的使用。随着电压的增大，琼脂糖凝胶的分辨有效范围减小。为获得大于2kb的DNA 片段的最佳分辨率，以5V/cm 或者更低的电压进行电泳（两个电极之间的距离，cm) 。5-10 V/cm 可适用于大多数的胶。对一些缓冲液来说， 100 V 大约是50 mA 。
- 如果电泳过夜，总电压可以是20-25 V 。可以在第二天早上调高电压。
- 采用稳功率而不是稳压或者稳流可以防止大的电压峰或者产生过热。
- 以比普通胶慢得多的速度电泳低熔点胶，避免产热。
染色
- 胶融化之后加入溴化乙锭。每10 ml 琼脂糖溶液加1 μI 10 mg/ml 的溴化乙锭。
- 并不一定要往缓冲液中加溴化乙锭，可以在电泳后染色，胶体中的溴化乙锭已足够看到大多数条带。
分析
- 胶中的DNA 可以通过紫外透视灯观察。
- 戴手套，把胶平放在塑料薄膜上。可以用一个托架或者盘子来移取胶／塑料薄膜，但是托盘将会吸收过多的紫外线，可能看不到染色较浅的条带。
- 没有经RNA 酶处理的DNA 胶经常可以看到在胶的底部类似扩散条带的tRNA 。
- 为什么会有这么多的DNA 条带？即未被酶切的质粒DNA 可能在胶上呈现不止一条。
因为超螺旋环形（未被酶切） 、带切口环形（部分酶切）以及线性（完全酶切） DN在胶上以不同速度迁移，因此一个未完全酶切的DNA 可能显示三条不同的条带。
- 很难预测哪一条带是哪一个DNA, 因为琼脂糖浓度、电流强度与缓冲液类型都有一定影响，但是一般来讲，超螺旋DNA 像一颗致密子弹一样穿过凝胶，跑得最快，线性及切口DNA 紧随其后。
制胶
琼脂糖凝胶
- DNA 胶现配现用。事先配制的胶可以储存在电泳缓冲液中或者包在塑料薄膜中， 置于冰箱过夜。
- 利用稀释后的10X 贮液和琼脂糖来制胶。在三角烧瓶中配制所需的量，或者在玻璃瓶中配制足以制成几块的胶。琼脂糖会固化，但是可以在微波炉中重新融化。储存琼脂糖／缓冲液＂溶液＂于室温。
- 琼脂糖有几个级别。越纯（越昂贵）污染的蛋白质越少，盐类与其他多糖等污染物也越少。也有适于分离不同大小核昔酸的琼脂糖。如果需要回收DNA, 使用你能承受的最贵的琼脂糖，因为污染物可能抑制酶活性，成为成功克隆的主要障碍。
微波炉加热
- 把盖子松松地放在瓶子上，必须能让空气流出，否则瓶子有可能爆炸。如用的是烧瓶，用大一点的，减少暴沸的可能。你可以让口开着或者用塑料膜松松地扎在开口上，不要用铝箔！
- 把微波炉调到高温。新鲜配制的琼脂糖比固化的琼脂糖需要更长的加热时间。100 ml 可能需要3~5mm，更多的话大约6-l0min 。
- 1 min 后，停掉微波炉，戴着手套抓住瓶子，摇转瓶子及其内容物。混合均匀的东西加热得更快更平稳。
- 把瓶子放回微波炉中再加热。1 min 后停止，摇匀。
- 再把瓶子放回微波炉加热，直到即将沸腾。
- 用夹子或者耐热手套取出瓶子。
- 待琼脂糖冷却，直到能用手触摸。倒胶之前摇匀。如果发现部分琼脂糖已经开始固化，用微波炉稍稍加热一下。