单层细胞如何用胰蛋白酶处理？

下述方案描述的是采用胰蛋白酶处理细胞，进行细胞的传代或收集。维持细胞系的方法通常为每周传代一次，在传代的前一天换培养液；但是某些细胞系需要更频繁的传代。每种细胞系应单独传代以免细胞系交叉污染。超净工作台内不能同时放置一个以上细胞系。

• 吸干培养单层细胞的细胞培养瓶或培养皿中的培养液。
• 加入0.05％胰蛋白酶工作液(T-25 细胞培养瓶加入1ml; T-75 细胞培养瓶加入3m1) 。

无菌的10x 或lx 胰蛋白酶／即EDTA 工作液可以按照下列配方配制：

胰蛋白酶1x 工作液(0.05%)
胰蛋白酶/EDTA 10x 储存液	100ml
NaCl	7.1g
kCl	0.4g
葡萄糖	1.0g
NaHCO3	0.35g
1 ％酚红	1.0ml
H2O	900ml
调节pH 至7.2
胰蛋白酶/EDTA l0x 储存液
胰蛋白酶(1:250)	5.0g
EDTA.四钠盐	2.0g
NaCl	0.85g
H2O	100ml

-20℃ 储存胰蛋白酶/EDTA 10 x 储存液和1x 工作液。小量分装物可置4℃ 保存1 – 2周。胰蛋白酶放置于37℃ 的时间应尽可能缩短以免胰蛋白酶降解、酶活性下降

• 快速地前后旋转细胞培养瓶4~5 次以使胰蛋白酶包被所有瓶内细胞
• 检查细胞，不要待细胞脱落后才吸除胰蛋自酶工作液
• 另加l~3ml 胰蛋白酶工作液，再旋转细胞培养瓶4-5 次
• 注意在细胞尚未脱落前吸除胰蛋白酶工作液
• 将细胞培养瓶盖松松拧上后置细胞培养瓶于37℃ 培养箱中2-5 分钟
• 用手轻拍细胞培养瓶使得瓶内的少量液体能够带下已经要脱壁的细胞，检查细胞脱落情况。若无细胞脱落将细胞培养瓶再放回37℃ 培养箱中孵育数分钟。继续轻拍细胞培养瓶直至细胞完全脱落
• 再悬细胞于细胞培养液内(2 ~ 5ml/T-25 细胞培养瓶）
• 轻轻吹打细胞使得团状细胞分散，以需要的细胞密度接种细胞

注意事项

• 如果采用含有EDTA 鳌合剂的溶液作为预洗液，该传代方案中胰蛋白酶的用量可减少。在此种情况下，步骤2 可作修改，因为采用不含胰蛋白酶的预洗液。
  预洗液
  

  EDTA• 四钠盐	2.0g
  NaCl	8.0g
  kCl	0.4g
  葡萄糖	I.0g
  NaHCO3	0.35g
  1% 酚红	lml
  H2O	900ml
  调节pH 至7.2

对于对胰蛋白酶不是很敏感的细胞系，下面的决速胰蛋白酶处狸方案可供选择

• 用PBS洗涤单层细胞。
• 加人足够量的lx 胰蛋白酶工作液以覆盖所有细胞， 37℃孵育5 分钟
• 检查细胞脱落情况，吸取胰蛋白酶工作液中的细胞，用培养液稀释至欲接种的细胞数