细胞的冷冻和储存

细胞生长时的表型会发生改变或漂变，所以细胞必须计数，计数后应马上冻存。

冷冻细胞前

• 检查冷冻细胞所需试剂和器具是否备齐。
• 确认有无菌的可用于冷冻的冻存管 。
• 确认液氮罐里是否有冻存细胞的位置。

冷冻细胞

• 将培养基中的细胞培养至对数生长期。
• 进行活细胞计数，不要冻存死细胞比例高达20％以上的细胞。
• 决定冻存量，安排需要几个冻存管。

冻存细胞在融化时要稀释10 倍，而稀释后的液体是5X种子液。

例如：如果种子液的密度为5.0 X 10⁵ 个／ ml, 那么融化后重新悬浮细胞时细胞的密度为2. 5 X 10⁶ 个／ ml, 所以冻存细胞时的细胞密度为2.5 X 10⁷ 个／ ml 。

• 准备好冷冻培养基， 分装成1 ml, 冻存培养基通常包括一般培养基、10%~20%血清、5%~10％的甘油或二甲基亚砜。如果你不清楚用什么，那么就使用20％的血清和10％的二甲基亚砜。
• 在冷冻培养基中用移液管小心吹打粒状沉淀。
• 每个冻存管中分装1 ml 冻存培养基，放置在冰上操作。
• 把冻存管放入冻存盒中，做好标记，放入-60C 或更低温度的冰箱，放置16~24 小时。
• 倒些液氮至冰盒内，把细胞从冰箱转移到液氮罐之间要把细胞放在这样的冰盒内。如果没有现成的液氮，可以把细胞放在干冰上。
• 将细胞放置在合适的位置，立即做好记录。

液氮的使用

• 细胞常常保存在液氮罐或是液氮制冷柜中，但是要每隔几个星期补充液氮
• 自动填充液氮的罐子，必须定期检查，以保证管道的畅通以及液氮罐没有空掉。
• 在操作液氮罐内容器时要戴好厚手套，否则会冻伤手臂。
• 从液氮罐内拿出细胞时至少也应戴上乳胶手套
• 不要在液氮罐内悬吊物品，也不要吸入气化后的液氮，用手挥开液氮后，就能看见液面了。

• 戴好保护眼睛的眼罩，以免操作冻存管时，冻存管爆炸溅伤眼睛。

• 决不能把没有拧紧的管子放入液氮中，而且要提前找负责液氮罐管理的人员确定位置，不要乱放。

• 不要关闭警报，定期检查。
• 如果听到了液氮罐的报警声，立即通知实验室管理人员。如果是周末或凌晨，则先检查确认是否是由于液氮面过低或温度过高引起的报警，再联系负责液氮罐的人员。