如何提高qPCR反应的灵敏度和特异性？

1. 首先确定模板RNA完整性好，无DNA污染。
2. RNA模板中不应含有扩增反应抑制剂。
3. 为了防止模板降解，在反应体系中加入RNase抑制剂RNasin。
4. 使用适量的模板RNA，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
5. 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
6. 设计引物时，避免在引物3’端含有互补序列，避免形成内部发卡结构。
7. 可使用engreen的qPCR试剂，选用化学修饰的热启动酶，扩增效率和灵敏度更高。