1.组织培养试剂
优化细胞生长条件。只使用新鲜配制的培养基和添加剂,并经可能减少所用试剂的变更。
基础培养基—目前所使用的各种市售培养基
2.细胞生长状态
密切观察您的细胞;确保它们状态良好。在开始转染细胞之前,先制定一个适当的种板方案,使细胞密度从转染开始到结束都保持最佳状态。
增加成功几率—细胞是转染过程中的一个关键元素,它可以是影响结果的一致性和质量的最重要的变量。
此外,还常用促有丝分裂刺激物
贴壁细胞相比较悬浮细胞—在转染效率方面贴壁细胞和悬浮细胞之间的差异显著。天生趋于悬浮的细胞
3.载体DNA
检查纯化所得的载体质量。确定支持其正常功能的基因序列是否适合于您的细胞体系。在对您细胞体系的参数进行测定时,一定要选用一种您已知具有功能的对照载体。
载体的完整性—种载体是否具有功能取决于它结构的完整性。转染效率受到质粒制备物的超螺旋结构和舒展结构之间比例、双螺旋中断、核酸酶的降解,以及来自于储存和处理过程中的物理压力的影响。
4.转染方案
转染复合物的制备—诸如转染试剂/DNA配比,离子强度,缓冲液pH值,以及温度等变量都会影响到转染复合物的组成和功能。质粒既可在无菌水又可在TE缓冲液中稀释。如果您要使用一种市售的转染试剂,就应当仔细阅读该试剂所提供的使用说明。需要对试剂提供方给予一定的信赖;除非您有很好的理由支持您做出改变,否则就应当严格按照他们所推荐的转染方案。在不含血清或其他蛋白的培养基中制备转染复合物;如果制备复合物所使用的培养基含有血清,它就会对转染产生抑制。推荐使用Entranster试剂,培养基可加抗生素和血清,有助于提高转染效率。
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