磷酸钙-DNA共沉淀法的原理和步骤

前些时间有微友在平台上咨询细胞转染的事项，并对一篇博客文章《为什么磷酸钙转染并不稳定？为什么磷酸钙转染并不经济？》比较感兴趣。在这里，对这位微友的疑惑进行更加全方位的了解，在此将磷酸钙转染的原理和步骤和大家分享，以供交流讨论。

核酸以磷酸钙-DNA 共沉淀物的形式出现时，可使 DNA 附在细胞表面，这有利于细胞吞入摄取核酸，或通过细胞膜脂相收缩时裂开的空隙进入细胞内，进入细胞的DNA，仅有1%～5%可以进入细胞核中，其中仅有不到1%的DNA可以与细胞 DNA 整合，在细胞中进行稳定表达，基因转导的频率大约为10^-4，这项技术可以用于任何DNA导入哺乳类动物进行暂时性表达或长期转化的研究。该方法往往被用于贴壁细胞的转染。

1. 试剂的配制

(1)2×HBS 1.63 g NaCl ； 1.19g Hepes； 0.023 g Na₂ PO₄ ·2H₂ O； 加水至100 ml pH 7.1 过滤，4℃保存

(2)2mmol/L CaCl₂ 过滤除菌

(3)TE：0.1mmol/L EDTA，1mmol/L Tris-HCL PH 8.0

(4)G418(新霉素G418)液：1g G418溶于1mmol/L Hepes液中，加H₂ O至10mL过滤除菌4℃保存。

(5)G418选择培养基：用含10%胎牛血清的DMEM培养液配制G418，G418浓度为200～ 800mg/L

注意：对受体细胞先做预试验，选用浓度为在10～14天内能杀死细胞50%以上的最低浓度。

2. 操作步骤

(1)供体DNA制备：方法按前介绍的DNA提取法提取，溶于TE中，40mg/L。

(2)受体细胞的培养：研究癌基因转移应选择不含人类Alu序列的动物细胞系作为受体细胞。如小鼠NIH3T3胚成纤维细胞系等，该细胞有一定自发转化倾向，一般在转染前一天接种细胞，接种密度为2×10⁴ /cm² ,用含10%胎牛血清的DMEM液，37℃、5%CO₂ 培养，待细胞占50～70%瓶底面积时，用于转染试验。

(3)DNA-磷酸钙沉淀物的制备

①将供体细胞DNA和PSV2-neo质粒载体DNA用TE配制成40mg/L的DNA溶液，同时向供体细胞DNA液200μl中加入带基因neo质粒DNA液(20mg/L)220μl和2×HBS 250μl(PSV2-neo为1～2mg/L的使用量)。

②取500μl上述DNA溶液加入硅化试管中，缓慢加入3.1ml、2mol/L CaCl₂ 混匀30秒。

③然后立即混旋，室温下静置30分钟，待溶液轻度混浊后，吹打后即用于转染受体细胞。

(4)转染受体细胞

①将处于对数生长期已占瓶底50～70% 的受体细胞，在转染前4小时更换一次新鲜培养基，每瓶5ml（25ml培养瓶）。

②吸取0.5mLDNA-磷酸钙沉淀，加入含5mL培养液的细胞瓶中摇匀。

③置37℃ 5% CO₂ 培养24h或更长，使细胞充分吸入DNA-磷酸钙结晶颗粒。

④更换新鲜培养基，继续培养24小时，诱导转染基因的表达。

⑤更换浓度 800mg/L的G418选择培养液进行筛选。同时设有未能转染的对照细胞。

⑥培养大约3～5天，对照细胞大部分死亡，这时转染细胞更换浓度为200mg/L的G418选择培养基，每3～4天更换一次选择培养基。

⑦ 2 周后，对照细胞死亡，在转染的细胞瓶中可见有抗药性的细胞克隆出现，待其增大后再进行化和扩大培养，可建立转化细胞株，并做进一步鉴定。