siRNA转染常见问题及解决方案

1. RNA与转染试剂比例不佳
由于RNA序列差异、合成条件不同以及是否带有荧光等标记，决定了RNA和转染试剂在不同情况下会有不同的最佳条件，建议先进行预实验优化。

RNA浓度和转染试剂量的优化(24well)

1	2		3		4
RNA工作浓度	25nM	50nM		100nM	150nM
每孔RNA的量(pmol)	0.17μg(12.5pmol)	0.33μg(25pmol)		0.67μg(50pmol)	1μg(75pmol)
每孔转染试剂量	0.25μl	0.5μl		1μl	1.5μl

2. 细胞密度不佳
调整细胞密度到转染时汇合度为20-40%。成功转染siRNA的细胞会产生目标基因表达下调，但未成功转染的细胞却不受影响，这时转染效率和总的细胞数量就很重要，一般细胞数量较少时转染效率高。由于siRNA沉默时效性的影响，转染后48小时才能进行进行qRT-PCR检测，转染后48-72小时才能进行蛋白检测。如果转染时铺板密度较高，细胞一方面转染效果不理想，直接影响沉默效果和数据可靠性，另一方面，48小时甚至更长时间后，沉默检测最佳点时，过于密集的细胞将影响细胞状态，从而影响实验结果。

3. RNA效率不高
选择最优RNA，并采用已知高效的RNA做对照。siRNA的合成需要注意的是一定要选用高纯度的siRNA，siRNA的纯度直接关系到转染效率和沉默效率。siRNA的工作浓度和siRNA的设计、细胞种类、目标基因有关。建议一定进行相关的预实验优化各条件。

4. RNA酶污染
建议无RNA酶和内毒素的吸头、离心管和溶液等材料和实验器具。

5. 转染后培养时间不够
在mRNA水平可以到48小时以后验证结果，在蛋白水平可以到72小时后验证结果。siRNA的沉默效果是有时效性的，在最佳的时间点观察，会得到更加明显的沉默效果，这个时间点的确定不能以同一株细胞转染DNA的经验确定，因为一个是消耗mRNA，一个是产生mRNA。对转染siRNA，在核酸水平，转染后8-48小时，即可观察到mRNA水平的逐步下降，一般来说，转染后48小时进行qRT-PCR检测通常会得到漂亮的结果。

6. 培养基毒性
采用含10-20%血清的全培养基。使用脂质体等转染试剂时，由于含血清转染会将血清中的蛋白带入细胞，引发细胞毒性，导致转染效率降低，故不能有血清转染。EntransterTM只浓缩包裹核酸不会将血清带入细胞，所以可以有血清转染，同时由于血清的存在，有利于细胞的状态维护，故能提高转染效率。

7. 细胞污染
建议彻底清洁所有细胞培养相关用品

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