Real-Time qPCR常见的八大问题分析

1. 无Ct值出现

• 检测荧光信号的步骤有误: 一般SG法采用72℃延伸时采集，Taqman法则一般在退火结束时或延伸结束采集信号。
• 引物或探针降解: 可通过PAGE电泳检测其完整性。
• 模板量不足: 对未知浓度的样品应从系列稀释样本的最高浓度做起。
• 模板降解: 避免样品制备中杂质的引入及反复冻融的情况。

2. Ct值出现过晚（Ct>38）

• 扩增效率低: 反应条件不够优化。设计更好的引物或探针；改用三步法进行反应；适当降低退火温度；增加镁离子浓度等。
• PCR各种反应成分的降解或加样量的不足。
• PCR产物太长: 一般采用80-150bp的产物长度。

3. 标准曲线线性关系不佳

• 加样存在误差:   使得标准品不呈梯度。
• 标准品出现降解: 应避免标准品反复冻融，或重新制备并稀释标准品。
• 引物或探针不佳: 重新设计更好的引物和探针
• 模板中存在抑制物，或模板浓度过高

4. 负对照有信号

• 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
• 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
• 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
• 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

5. 溶解曲线不止一个主峰

• 引物设计不够优化：应避免引物二聚体和发夹结构的出现。
• 引物浓度不佳：适当降低引物的浓度，并注意上下游引物的浓度配比。
• 镁离子浓度过高：适当降低镁离子浓度，或选择更合适的mix试剂盒。
• 模板有基因组的污染：RNA提取过程中避免基因组DNA的引入，或通过引物设计避免非特异扩增。

6. 扩增效率低

• 反应试剂中部分成分特别是荧光染料降解。
• 反应条件不够优化：可适当降低退火温度或改为三步扩增法。
• 反应体系中有PCR反应抑制物：一般是加入模板时所引入，应先把模板
• 适度稀释，再加入反应体系中，减少抑制物的影响。

7. 同一试剂在不同仪器上产生不同的曲线产生，如何判断？

判断标准：扩增效率，灵敏度，特异性

如果扩增效率在90%-110%，都是特异性扩增，都可以把数据用于分析。

8. 扩增曲线的异常扩增？比如“S”型曲线？

• 参比染料设定不正确(MasterMix不加参比染料时，选NONE)
• 模板的浓度太高或者降解
• 荧光染料的降解