英格恩生物技术博客 生物实验干货分享
MTT法又称MTT比色法，是一种检测细胞存活的方法。MTT，即四氮唑化合物，能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶发生反应而将淡黄色的MTT还原为不溶于水的蓝紫色结晶物甲瓒而沉积在目的细胞中。在一定的细胞数范围内，甲瓒的形成量与细胞数成线性关系。用DMSO将细胞中沉积的蓝紫色甲瓒溶解后，在多功能酶标仪上检测其相应的吸光值，计算细胞浓度。
需注意的是，MTT只能与活细胞线粒体中的琥珀酸脱氢酶发生反应而死细胞无此功能，故只适用于测定活细胞的细胞存活率。此外，MTT法只能检测细胞的相对数量和相对活力，而无法检测细胞的绝对的数量。用酶标仪检测细胞吸光值时，为了保证细胞浓度与吸光值之间的线性关系，吸光值最好控制都在0-0.7范围内。
普通MTT法实验步骤：
1：接种细胞：用含10％胎小牛血清得培养液配成单个细胞悬液，以每孔1000-10000个细胞接种到96孔板，每孔体积200ul.
2: 培养细胞：同一般培养条件，培养3-5天（可根据试验目的和要求决定培养时间）。
3：呈色：培养3-5天后，每孔加MTT溶液（5mg/ml用PBS制，pH=7.4)20ul.继续孵育4 h，终止培养，小心吸弃孔内培养上清液，对于悬浮细胞需要离心后再吸弃孔内培养上清液。每孔加150ul DMSO，振荡10min，使结晶物充分融解。
4：比色：选择490nm波长，在酶联免疫监测仪上测定各孔光吸收值，记录结果，以时间为横坐标，吸光值为纵坐标绘制细胞生长曲线。
药物MTT法实验步骤
贴壁细胞：
1: 收集对数期细胞，调整细胞悬液浓度，每孔加入100ul,铺板使待测细胞调密度 1000- 10000 孔，（边缘孔用无菌PBS填充）。
2: 5%CO2，37℃孵育，至细胞单层铺满孔底（96孔平底板）,加入浓度梯度的药物,原则上，细胞贴壁后即可加药，或两小时，或半天时间，但我们常在前一天下午铺板，次日上午加药.一般5-7个梯度,每孔100ul,设3-5个复孔.建议设5个，否则难以反应真实情况
3: 5%CO2，37℃孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
4: 每孔加入20ulMTT溶液（5mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4h。若药物与MTT能够反应，可先离心后弃去培养液，小心用PBS冲2-3遍后，再加入含MTT的培养液。
5: 终止培养，小心吸去孔内培养液。
6: 每孔加入150ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD490nm处测量各孔的吸光值。
7: 同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜）。
悬浮细胞：
1: 收集对数期细胞，调节细胞悬液浓度1×106/ml，按次序将①补足的无血清培养基40ul ；②加Actinomycin D（有毒性）10ul用培养液稀释 (储存液100mg/ml，需预试寻找最佳稀释度，1:10-1:20)；③需检测物10ul；④细胞悬液50ul（即5×104cell/孔），共100ul加入到96孔板（边缘孔用无菌水填充）。每板设对照（加100ml 培养基）
2: 置37℃，5%CO2孵育16-48小时，倒置显微镜下观察。
3: 每孔加入10 ul MTT溶液（5 mg/ml，即0.5%MTT），继续培养4 h。（悬浮细胞推荐使用WST-1，培养4 h后可跳过步骤4），直接酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值）
4、离心（1000转x10min），小心吸掉上清，每孔加入100 ul二甲基亚砜，置摇床上低速振荡10 min，使结晶物充分溶解。在酶联免疫检测仪OD570nm（630nm校准）测量各孔的吸光值。
5、同时设置调零孔（培养基、MTT、二甲基亚砜），对照孔（细胞、相同浓度的药物溶解介质、培养液、MTT、二甲基亚砜），每组设定3复孔。
注意事项
(1)培养好目的细胞
将目的细胞培养好是一切细胞实验的基础。如果不知道如何培养细胞，可查看相关的文献，不同细胞有各自的不同特点，可根据自己的实验要求及培养经验适当调整。培养细胞的过程中，注意无菌操作，切记引起细胞污染。
(2)细胞铺板
将细胞培养一段时间后，大概了解细胞的增殖情况。根据细胞的生长情况反推铺板时的细胞浓度。将消化后的细胞反复吹打，充分混匀尽量使细胞消化成单个细胞，计数再铺板。此时，注意不要过分依赖细胞计数，因为细胞计数时，取样量较多（10微升），存在细胞颗粒的不均匀分布会直接影响后期实验，故掌握细胞计数，但细胞铺板时不能完全依赖它。选择适当得细胞接种浓度。
(3) 避免血清干扰
一般选小于10％的胎牛血清的培养液进行试验。在呈色后尽量吸尽孔内残余培养液。
(4)设空白对照
与试验平行不加细胞只加培养液的空白对照。其他试验步骤保持一致，
最后比色以空白调零。
(5)加MTT
如果待检测药物有氧化还原性，则加MTT前换一次液或用PBS将细胞清洗一遍，防止待测药物将MTT还原成棕褐色沉淀，影响实验结果。注意，加入MTT溶液时，在避光条件下进行。
(6)加DMSO溶液
加入MTT避光培养4h后，弃去各孔中的液体并加入500微升的DMSO（24孔板）。为了将沉淀完全溶解，加入DMSO后在摇床上震摇10min。提醒：如果目的细胞贴壁不牢固，弃去液体时容易丢失部分细胞沉淀，因此贴壁不好的细胞在铺板前预处理（用多聚赖氨酸处理），或在弃液前用离心机离心，收集部分细胞沉淀。
(7) 一般每孔细胞浓度在20000个/ml为宜，MTT加20ul，作用四小时后洗掉上清液，注意不要将甲瓉洗掉，然后每孔加150ul DMSO，在脱色摇床上振荡10分钟，然后测吸光值。
(8)MTT实验吸光度最后要在0-0.7之间，超出这个范围就不是直线关系。