质粒DNA的提取与鉴定

$\mathrm{一}$碱裂解法提取质粒

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{原}\mathrm{理}$$

碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA在拓扑学上的差异来分离它们。在pH值介于12.0~12.5这个狭窄的范围内,线性的DNA双螺旋结构解开而被变性,尽管在这样的条件下,共价闭环质粒DNA的氢键会被断裂,但两条互补链彼此相互盘绕,仍会紧密地结合在一起。当加入pH4.8的乙酸钾高盐缓冲液恢复Ph至中性时，共价闭合环状质粒DNA的两条互补链仍保持在一起，因此复性迅速而准确，在而线性的染色体DNA的两条互补链彼此已完全分开，复性就不会那么迅速而准确，它们缠绕形成网状结构，通过离心，染色体DNA与不稳定的大分子RNA、蛋白质-SDS复合物等一起沉淀下来而被除去。

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{仪}\mathrm{器}\mathrm{与}\mathrm{设}\mathrm{备}$$

1.恒温培养箱 2.恒温摇床

3.台式离心机$\mathrm{最}\mathrm{大}\mathrm{转}\mathrm{速}4000rpm$ 4.冷冻高速离心机

5.高压灭菌锅 6.超净工作台

7.微量移液器 8.eppendorf tupe、tip

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{材}\mathrm{料}$$

1.葡萄糖 2.三羟甲基氨基甲烷$Tris$

3.乙二胺四乙酸$EDTA$ 4.氢氧化钠

5.十二烷基硫酸钠$SDS$ 6.乙酸钾

7.冰乙酸 8.氯仿

9.乙醇 10.胰RNA酶

11.氨苄青霉素 12.蔗糖

13.溴酚蓝 14.酚

15.β巯基乙醇 16.盐酸

17.含pUC18质粒的大肠杆菌

附：试剂的配制

1.溶液Ⅰ

50mmol/L 葡萄糖

5mmol/L 三羟甲基氨基甲烷$Tris$ Tris·HCl $pH8.0$

10mmol/L 乙二胺四乙酸$EDTA$$pH8.0$

2.溶液Ⅱ

0.4 mol/L NaOH, 2%SDS, 用前等体积混合

3.溶液Ⅲ

5mmol/L 乙酸钾 60 ml

冰乙酸 11.5 ml

水 28.5 ml

4.TE缓冲液

10mmol/L Tris·HCl

1 mmol/L EDTA$pH8.0$

5.70%乙醇$\mathrm{放}-20℃\mathrm{冰}\mathrm{箱}\mathrm{中},\mathrm{用}\mathrm{后}\mathrm{即}\mathrm{放}\mathrm{回}$

6.胰RNA酶

将RNA酶溶于10mmol/L Tris·HCl$pH7.5$、15mmol/L NaCl中，配成10mg/ml的浓度，于100℃加热15min,缓慢冷却至室温，保存于-20℃。

7.终止液:40%蔗糖、0.25%溴蓝酚

8.酚

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{步}\mathrm{骤}$$

$\mathrm{一}$ 提取质粒

1.将2ml含相应抗生素的LB液体培养基加入到试管中，接入含质粒的大肠杆菌，37℃振荡培养过夜。

2.取1.5ml培养物倒入微量离心管中，4000rpm，离心2min。

3.吸去培养液，使细胞沉淀尽可能干燥。

4.将细菌沉淀悬浮于100μl溶液Ⅰ中，充分混匀，室温放置10 min。

5.加200μl溶液Ⅱ$\mathrm{新}\mathrm{鲜}\mathrm{配}\mathrm{制}$，混匀内容物，将离心管放冰上5 min。

6.加入150μl溶液Ⅲ$\mathrm{冰}\mathrm{上}\mathrm{预}\mathrm{冷}$，盖紧管口，颠倒数次使混匀。

7.1200rpm，离心15 min，将上清转至另一离心管中。

8.向上清中加入等体积酚：氯仿$\mathrm{去}\mathrm{蛋}\mathrm{白}$，反复混匀，12000rpm，离心5min,将上清转移到另一离心管中.

9.向上清加入2倍体积乙醇,混匀后,室温放置5-10min。12000rpm离心5min。倒去上清液，把离心管倒扣在吸水纸上，吸干液体。

10.用1ml70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀，振荡并离心，倒去上清液，真空抽干或空气中干燥。

11.加50μl TE缓冲液，其中含有20μg/ml的胰RNA酶，使DNA完全溶解，-20℃保存。

$\mathrm{二}$琼脂糖凝胶电泳检测DNA

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{原}\mathrm{理}$$

琼脂糖凝胶电泳是分离鉴定和纯化DNA片段的常用方法。DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应，DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。由于糖磷酸骨架在结构上的重复性质，相同数量的双链DNA几乎具有等量的净电荷，因此它们能以同样的速度向正极方向移动。不同浓度琼脂糖凝胶可以分离从200bp至50kb的DNA片段。在琼脂糖溶液中加入低浓度的溴化乙锭$ethidumbromide,EB$，在紫外光下可以检出 10ng的DNA条带，在电场中，pH8.0条件下，凝胶中带负电荷的DNA向阳极迁移。

琼脂糖凝胶有如下特点：

$1$ DNA的分子大小 在凝胶基质中其迁移速率与碱基对数目的常用对数值成反比，分子越大迁移得越慢。

$2$ 琼脂糖浓度 一个特定大小的线形DNA分子,其迁移速度在不同浓度的琼脂糖凝胶中各不相同。DNA电泳迁移率$u$的对数与凝胶浓度$t$成线性关系。

$3$ 电压 低电压时，线状DNA片段迁移速率与所加电压成正比。但是随着电场强度的增加，不同分子量DNA片段的迁移率将以不同的幅度增长，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围将缩小。要使大于2kb的DNA片段的分辨率达到最大，所加电压不得超过5v/cm。

$4$ 电泳温度 DNA在琼脂糖凝胶电泳中的电泳行为受电泳时的温度影响不明显，不同大小的DNA片段其相对迁移速率在4℃与30℃之间不发生明显改变，但浓度低于0.5%的凝胶或低熔点凝胶较为脆弱，最好在4℃条件下电泳。

$5$ 嵌入染料 荧光染料溴化乙锭用于检测琼脂糖凝胶中的DNA，染料嵌入到堆积的碱基对间并拉长线状和带缺口的环状DNA,使其刚性更强,还会使线状迁移率降低15%。

$6$ 离子强度 电泳缓冲液的组成及其离子强度影响DNA电泳迁移率。在没有离子存在时$\mathrm{如}\mathrm{误}\mathrm{用}\mathrm{蒸}\mathrm{馏}\mathrm{水}\mathrm{配}\mathrm{制}\mathrm{凝}\mathrm{胶}，\mathrm{电}\mathrm{导}\mathrm{率}\mathrm{最}\mathrm{小}，DNA\mathrm{几}\mathrm{乎}\mathrm{不}\mathrm{移}\mathrm{动}，\mathrm{在}\mathrm{高}\mathrm{离}\mathrm{子}\mathrm{强}\mathrm{度}\mathrm{的}\mathrm{缓}\mathrm{冲}\mathrm{液}\mathrm{中}(\mathrm{如}\mathrm{误}\mathrm{加}10\times \mathrm{电}\mathrm{泳}\mathrm{缓}\mathrm{冲}\mathrm{液}$，则电导很高并明显产热，严重时会引起凝胶熔化。

对于天然的双链，常用的几种电泳缓冲液有TAE、TBE等，一般配制成浓缩母液，室温保存，用时稀释。

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{仪}\mathrm{器}\mathrm{与}\mathrm{设}\mathrm{备}$$

1. 恒温培养箱 2. 琼脂糖凝胶电泳系统
2. 高压灭菌锅 4. 紫外线透射仪

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{材}\mathrm{料}$$

1.三羟甲基氨基甲烷$Tris$ 2.硼酸

3.乙二胺四乙酸$EDTA$ 4.溴酚蓝

5.蔗糖 6.琼脂糖

7.溴化乙锭 8.DNA marker

9.DNA样品

$$\mathrm{实}\mathrm{验}\mathrm{步}\mathrm{骤}$$

1.缓冲液的配制

① 5×TBE$5\mathrm{倍}\mathrm{体}\mathrm{积}\mathrm{的}TBE\mathrm{贮}\mathrm{存}\mathrm{液}$

配1000ml 5×TBE:

Tris 54g

硼酸 27.5g

0.5mol/l EDTA 20ml

Ph8.0

② 凝胶加样缓冲液$6\times$

溴酚蓝 0.25%

蔗糖 40%

③溴化乙锭溶液$EB$ 0.5μg/ml

2.制备琼脂糖凝胶

按照被分离DNA的大小,决定凝胶中琼脂糖的百分含量。可参照下表：

琼脂糖凝胶浓度 线性DNA的有效分离范围

0.3% 5-60 kb

0.6% 1-20 kb

0.7% 0.8-10 kb

0.9% 0.5-7 kb

1.2% 0.4-6 kb

1.5% 0.2-4 kb

2.0% 0.1-3 kb

3.胶板的制备

$1$ 用高压灭菌指示纸带将洗静、干燥的玻璃板的边缘$\mathrm{或}\mathrm{电}\mathrm{泳}\mathrm{装}\mathrm{置}\mathrm{所}\mathrm{皿}\mathrm{备}\mathrm{的}\mathrm{塑}\mathrm{料}\mathrm{盘}\mathrm{的}\mathrm{开}\mathrm{口}$封住，形成一个胶膜$\mathrm{将}\mathrm{胶}\mathrm{膜}\mathrm{放}\mathrm{在}\mathrm{工}\mathrm{作}\mathrm{台}\mathrm{的}\mathrm{水}\mathrm{平}\mathrm{位}\mathrm{置}\mathrm{上}，\mathrm{用}\mathrm{水}\mathrm{平}\mathrm{仪}\mathrm{校}\mathrm{正}$。

$2$ 配制足够用于灌满电泳槽和制备凝胶所需的电泳缓冲液$1\times TBE$。准确称量的琼脂糖粉。缓冲液不宜超过锥瓶或玻璃瓶的50%容量。 在电泳槽和凝胶中务必使用同一批次的电泳缓冲液，离子强度或pH值的微小差异会在凝胶中形成前沿，从而大大影响DNA片段的迁移率 。

$3$ 在锥瓶的瓶颈上松松地包上一层厚纸。如用玻璃瓶，瓶盖须拧松。在沸水浴或微波炉中将悬浮加热至琼脂糖溶解。注意：琼脂糖溶液若在微波炉里加热过长时间，溶液将过热并暴沸。应核对溶液的体积在煮沸过程中是否由于蒸发而减少，必要时用缓冲液补充。

$4$ 使溶液冷却至60℃。加入溴化乙锭$\mathrm{用}\mathrm{水}\mathrm{配}\mathrm{制}\mathrm{成}10mg/ml\mathrm{的}\mathrm{贮}\mathrm{存}\mathrm{液}$到终浓度为0.5ug/ml，充分混匀。

$5$ 用移液器吸取少量琼脂糖溶液封固胶模边缘，凝固后，在距离底板0.5-10mm的位置上放置梳子，以便加入琼脂糖后可以形成完好的加样孔。如果梳子距玻璃板太近，则拔出梳子时孔底将有破裂的危险，破裂后会使样品从玻璃板之间渗透。

$6$将剩余的温热琼脂糖溶液倒入胶模中。凝胶的厚度在3-5mm之间。检查一下梳子的齿下或齿间是否有气泡。

$7$在凝胶完全凝固后$\mathrm{于}\mathrm{室}\mathrm{温}\mathrm{放}\mathrm{置}30-45\mathrm{分}\mathrm{钟}$ ，小心移去梳子和高压灭菌纸带，将凝胶放入电泳槽中。

低熔点琼脂糖凝胶及浓度低于0.5%的琼脂糖凝胶应冷却至4℃，并在冷库中电泳。

$8$加入恰好没过胶面约1mm深的足量电泳缓冲液。

4.加样

DNA样品与所需加样缓冲液混合后，用微量移液器，慢慢将混合物加至样品槽中。此时凝胶已浸没在缓冲液中。 一个加样孔的最大加样量依据DNA的数量及大小而定，一般为20-30μl样品。

已知大小的DNA标准，应同时加在凝胶的左凝胶的左侧和右侧孔内。确定未知DNA的大小。测量未知DNA的大小时，要所有样品都用相同的样品缓冲液。

5.电泳

在低电压条件下,线形DNA片段的迁移速度与电压成比例关系,但是,在电场增加时,不同相对分子质量的DNA片段泳动度的增加是有差别的。因此，随着电压的增加，琼脂糖凝胶的有效分离范围随之减小。为了获得电泳分离DNA片段的最大分辨率，电场强度不应高于5V/cm。当溴酚蓝指示剂移到到距离胶板下沿约1-2cm处，停止电泳。

 

 

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