细胞污染的心得体会

细胞培养的质量好坏是细胞相关实验的基石，许多朋友都曾经历过因为细胞污染影响实验进度的郁闷，被老板批评是小事，要是影响到正常毕业就是大事了。怎么分辨细胞污染，是不是细胞污染？是那种细胞污染？细胞污染后如何处理？

预防污染
细胞培养是个细致活儿，一不小心就会造成污染，最好养成良好无菌操作习惯。个人经验是，进实验室之前最好洗手，很多实验者都不bother，这是国人研究者的一种极端错误，我告诉大家，你仔细洗手比喷酒精效果还好。最好的是肥皂/香皂仔仔细细的洗手，一直到手腕，指甲缝都要洗。洗两遍是一个不错的选择。实验必备白大褂，而且一定要是长袖，袖口扎紧的那种，如果不能的话，把袖口窝向手臂。裸露的手腕部分一定也要喷酒精。最好是戴上手套后手请避免接触工作台外面，如果不得已接触，那再喷酒精。
细胞实验前，超净台/实验间紫外照射30min，细胞培养室有24h的空气消毒装置更好了。操作前70％酒精擦超净台消毒，酒精擦手，擦培养瓶，擦培养基瓶以及各种瓶子的口，总之，所有进超净台的物品最好都用酒精擦拭一遍。拿培养瓶和培养液时候尽量托下面拿，切忌不要拿瓶颈部位。有一点要注意的是，超净台里面的东西一定要尽量少放，东西太多活影响超净台内空气流通及空气除菌。实验过程中尽量避免打闹说笑。
每天观察细胞状态，一旦发现细胞不对劲（比如生长缓慢）立即进行处理。一些刚接触细胞的朋友可能有时拿不准情况，也迫切的希望得到帮助。怎么分辨细胞污染，是不是细胞污染？是那种细胞污染？细胞污染后如何处理？
细胞污染鉴别方法
这里告诉您判断污染的方法：如果是细菌污染，应该很快培基就浑浊了。如果是真菌感染，特别是初期感染，在低倍镜下可以看到小黑点，特别是成团的小黑点，要特别注意。如果无法确定，就换高倍镜，如果是死细胞，高倍镜下就可以分辨，而真菌高倍镜下仍然是小黑点。有些（比如支原体）污染，镜检是看不到的，但是细胞的生长异常。所以如果细胞生长异常，那么请扔掉，同时由于支原体空气传播，请检查自己的培养液和培养箱是不是污染。白色念珠菌是人体霉菌感染的常见霉菌种类，尽管我们有时感觉不到，但它就在你我的身边甚至身上存在着。霉菌污染多来自空气，所以做实验时说话聊天，或瓶口敞开时间太长，还有培养箱开关频繁是主要原因，应多找自身原因。培养箱水盘最好一个星期用酒精或0.2％的新吉灭擦一次，如果有紫外线照射就更好了
一旦细胞污染了，怎么解决呢？
一旦细胞污染了，怎么解决呢？当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的，我还是建议你把污染的扔掉，再复苏方便省事。如果不幸没有，不得不把细胞救活了。对于细菌污染（常见为金黄色葡萄球菌和大肠杆菌），可以用普通双抗（链霉素和青霉素）处理；若为霉菌或者真菌污染，加入两性霉素B清洗和培养，终浓度一般为2.5μg/ml（在30μg/ml时会有细胞毒性）。另外也可以选择在培养基里加3ug/ml的制霉菌素或放线菌素D。若为支原体或者黑胶虫污染，因为这个太难处理，处理的代价更大更麻烦，建议直接扔掉算了。以免造成实验室其他污染就得不偿失了。
对于贴壁生长的细胞，相对来说比较简单但很麻烦。以下我主要讨论贴壁生长的细胞。洁净区，并不是没有细菌，而是细菌的数量非常少，国家标准100级的洁净标准是浮游菌数不得超过5个每立方米，沉降菌数不得超过1个每培养皿。而国外的标准比我国的还要高一点，要求的数量更少。 所以在我们的洁净操作台里，并不是真正一个细菌都没有的，所以在操作的时候还是要尽量利索迅速地完成操作。尽量减少进入培养体系细菌的数量。所以处理细菌污染的重要原则就是：无限地稀释细菌的浓度，无限地减少细菌的数量！
1） 将污染的培养液倒掉，转烧瓶口，加入10mlPBS，适当晃动清洗培养瓶，然后倒掉。转烧瓶口。
2） 继续加入10mlPBS，同样方法晃动，清洗培养瓶，然后倒掉。
3） 继续加入5mlPBS，同样方法洗瓶，主要是培养面，然后倒掉。
4） 重复步骤3再洗。
5） 重复步骤3再洗。
6） 加入3-5ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
7） 加入3ml双抗，洗瓶，静置3-5分钟，然后吸出。
8） 再加入5mlPBS洗瓶，然后吸出。
9） 加入10ml培养液，加入2ml双抗，放置培养箱培养，5小时之后，倒掉培养基，加入PBS洗瓶两次，然后加入胰酶消化，吹打后置于离心机800-1000r/min离心，然后洗一次。置于新的培养瓶里培养，培养体系加入2ml双抗。
10） 24h之后，视情况换液，若仍然污染严重，培养基浑浊，重复以上步骤，若看不到污染物，则继续步骤1)、3）、4）、6）、8），然后加入培养液培养，培养体系加入2ml双抗.
11） 24h之后，若仍污染严重，可再重复一次，若还污染只能弃之（不过一般没有出现这种情况），若镜下不见污染物，则换液PBS洗瓶，正常培养。

很多人有个误区，认为进口血清都是贵，其实不然。GIBCO的 NCS，马血清，都比国产的便宜的多，质量好的多。只有FBS才很贵，很多时候国产血清往往是污染源，所以用国产血清要严格监控状态。
以上方法主要是针对贴壁生长的细胞，在操作的过程中，一定要小心操作动作，轻柔缓慢，切忌大动作鲁莽。防止细胞脱落。以上方法操作得当，基本上都能救活你的细胞。当然如果你的细胞仍有富余或者冻存的，我还是建议你把污染的扔掉，再复苏方便省事。这个拯救细胞还是主要针对你就只剩这一瓶细胞无路可退的时候。欢迎大家讨论！