G418筛选转染克隆的注意事项

G418作为稳定转染通用的一种筛选方式，在进行筛选前应该要注意几点：

1.    G418的浓度：G418是一种氨基糖苷类似物，它通过干扰核糖体功能来阻止哺乳动物细胞蛋白质的合成。因此在筛选过程中G418的浓度将对转染细胞的筛选产生很大的影响。在筛选之前最好进行条件优化确定最佳筛选浓度。尽管文献有报道筛选浓度，最好还是要自己亲自做一下筛选浓度的确定。

2.    细胞状态：细胞状态会影响对药物的敏感性。可以通过常规的培养步骤保持转染铺板前的细胞健康。每周传代一到两次，稀释程度使得下次传代前细胞几乎融合。不要使细胞保持融合超过24小时。

3.    细胞维护：根据培养基的颜色和细胞生长情况，定期更换新鲜培养基。

4.    其他抗生素的使用：对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是G418抗生素的竞争性抑制剂。在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。

5.    细胞保存：细胞培养在实验室中保存数月和数年后会经历突变，总染色体重组或基因调控变化等而演化。如果随时间发现这种变化，一管保存的新鲜的细胞可能会恢复原先的活性。比如，新鲜融化的NIH 3T3细胞比传代8次的细胞表现出更高的转染效率。融化细胞的进一步传代并没有降低转染效率。因此，如果观察到细胞活性降低，可以试着复苏新鲜培养的细胞以恢复最佳结果。

一、筛选曲线的建立

1. G418的配制：取G418共1g溶于1mol/L的HEPES溶液1ml中，加蒸馏水至10ml，过滤除菌，4℃保存；

2. 细胞培养：取待测培养细胞，制备成细胞悬液，按等量接种入多孔培养板中，培养6h左右开始加药；

3. 制备筛选培养基：在100~1000ug/ml范围内确定几个梯度，比如先做个100、400、800、1000ug/ml，按梯度浓度用培养基稀释G418制成筛选培养基；

4. 加G418筛选：吸除培养基，PBS洗涤一次，每孔中加入不同浓度的筛选培养基；

5. 换液：根据培养基的颜色和细胞生长情况，每隔3~5d更换一次筛选培养基；

6. 确定最佳筛选浓度：在筛选10~14d内能够杀死所有细胞的最小G418浓度即为最佳筛选浓度。

二、G418筛选转染克隆步骤：

1. 建立筛选曲线，确定最佳筛选浓度；

2. 细胞铺板：转染后24小时将贴壁的细胞传代（传代时，注意通过在显微镜下观察，控制细胞密度，不能使细胞太密集，应该少于生长表面的50%，参考为20%-30%）至15cm培养皿，加入15~20ml培养基（DMEM，含血清）进行培养；

3. 用最佳筛选浓度的G418对细胞进行筛选：铺板完成后，再过24小时，抗性表达，用最佳筛选浓度的G418进行筛选（对于Hela细胞，一般筛选终浓度为800ug/ml）。具体操作是去除旧的培养基，用PBS洗一次，将含有浓度为800ug/ml（以Hela为例）的培养基15~20ml加入培养皿内即可；

4. 换液：每日及时观察细胞，根据培养基的颜色和细胞生长情况，及时更换相同浓度（800ug/ml）的培养基，大概持续筛选一周左右，直至空白对照组（未转染组）细胞死亡大部分（至少30%以上）；

5. 撤药维持阶段：待空白组细胞大部分死亡后，将实验组（转染组）进行换液，此时所用培养基含G418的终浓度为200ug/ml（维持浓度），维持生长（若细胞仍有死亡，需要继续降低药的浓度，参考为50-100ug/ml），直至筛选克隆可见为止（大约2~3天）；

6. 分离克隆以获得最大数量细胞（提高克隆成活可能性），减少单个克隆受其他细胞污染的机会。具体操作是：a.用PBS洗含有克隆的培养物，圈出欲分离的克隆。从培养皿中除去液体，准备24孔板收集克隆；b.从培养皿中用牙签或者棉棒（经过高压）挑取已分离出的克隆（具体操作是先用棉棒蘸一下胰酶，再蘸一下克隆）；c.在24孔板的一个孔中（事先已加入完全培养基，不含G418）剧烈摇动牙签，使细胞沉于孔中，继续挑取下一个克隆；

7. CO2孵箱，温育细胞约两小时；

8. 两小时后，镜检培养皿，确定细胞是否附着。如果已经附着，用新鲜完全培养基（含50ug/ml G418）更换24孔板培养基，除去残留的胰蛋白酶，继续培养直到培养物长满；

9. 一旦小量培养物长满，转接到大的培养皿（通常先是6孔板），用50ug/ml的新鲜完全培养基维持培养，然后与同样类型的其他细胞一样处理即可。