细胞培养之新手必看

细胞培养技术是细胞学、遗传学、免疫学、实验医学和肿瘤学等多种学科研究的基础实验技术之一。通过细胞培养可以直接观察活细胞的形态结构和生命活动，联合各种技术进行各种物理、化学生物的研究。

一、准备工作
细胞培养的准备工作是很重要，也很复杂的一项工作，应予以重视。
1.无菌室及无菌操作台
无菌操作工作区域应保持清洁及宽敞，必要物品，例如试管架、吸管吸取器或吸管盒等可以暂时放置，其它实验用品用完即应移出，以利于气流之流通。实验用品以70% ethanol擦拭后才带入无菌操作台内。实验操作应在台面之中央无菌区域，勿在边缘之非无菌区域操作。实验进行前，无菌室及无菌操作台(laminar flow) 以紫外灯照射30-60 分钟灭菌，以70% ethanol擦拭无菌操作抬面，并开启无菌操作台风扇运转10 分钟后，才开始实验操作。
2. 实验材料的准备
2.1玻璃器皿的清洗、干燥、消毒：
1）细胞培养的和主要是玻璃容器与pasteur pipet，其它均为塑料无菌制品。
2）实验用的玻璃容器与pasteur pipet使用前都要进行清洗。新购玻璃血清瓶先以0.1~0.05 N HCl 浸泡数小时，洗净后才开始使用。
3）用过之玻璃血清瓶，以高压蒸汽灭菌，洗净后分别用一次与二次去离子水冲洗干净，勿加清洁剂清洗。
4）实验用玻璃血清瓶以铝箔纸包覆瓶盖，高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，置于oven中烘干。实验用玻璃pasteur pipet以干热灭菌170℃, 4 小时。
2.2培养容器：种类有Tflask，plates, dishes, roller bottle等，依实验需要使用。
2.3 培养基的配制及分装
1）液体培养基贮存于4℃ 冰箱，避免光照，实验进行前放在37℃ 水槽中温热。液体培养基（加血清）存放期为六个月，期间glutamine可能会分解，若细胞生长不佳，可以再添加适量glutamine。
2）粉末培养基(以1 升为例)之配制体积为900 ml，pH为7.2-7.4。NaHCO3 为另外添加，若将NaHCO3粉末直接加入液体培养基中会造成pH之误差，或局部过碱。因此粉末培养基及NaHCO3粉末应分别溶解后才混合，然后用CO2气体调整pH，而非用强酸(HCl)或强碱(NaOH)，因为氯离子对细胞生长可能有影响，且贮存时培养基的pH易发生改变。高压灭菌后添加血清。
3）为避免培养基污染，可以在培养基中添加双抗(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。若实验不或细胞不允许，可将培养基少量分装。操作均在无菌条件下进行。

2.4 抗生素
1）ATCC细胞库之细胞培养基不加抗生素
2）培养自其它实验室引进之细胞株，制作token freeze前培养基须添加抗生素，待token freeze通过污染测试后，大量培养时则不加抗生素。
3）寄送活细胞时，须将培养液充满整个flask时，则须添加抗生素(penicillin 100 units/ml + streptomycin 100 ug/ml)。
4）若要检测mycoplasma，则培养基内不可添加gentamicin，因gentamicin会抑制mycoplasma生长。
5）去除细菌污染之抗生素混合配方：penicillin 250units/ml, streptomycin 250ug/ml, neomycin 250ug/ml, bacitracin 2.5units/ml，注意混合使用后药物毒性会增强。
6）抗生素使用种类与浓度：

	工作浓度	储存温度	杀灭细菌
penicillin	100 units/ml	-20℃	G(+) bacteria
streptomycin	100 ug/ml	-20℃	G(+) and G(-) bacteria
chlotetracycline	50 ug/ml	-20℃	G(+) and G(-) bacteria
gentamicin	50 ug/ml	-20℃	G(+) and G(-) bacteria ,mycoplasma
amphotericin B	2.5 ug/ml	-20℃	yeast and molds
nystatin	50 ug/ml	-20℃	yeast and molds
fungizone	2.5 ug/ml	-20℃	yeast and molds

2.5血清
1）血清必须贮存于–20～–70℃，若存放于4℃，请勿超过一个月。如果一次无法用完一瓶，可将40～45ml 分装于无菌50ml离心管中，由于血清结冻时体积会增加约10 %， 必须预留此膨胀体积之空间，否则易发生污染或容器冻裂之情形。
2）一般厂商提供之血清为无菌，不需再无菌过滤。若发现血清有许多悬浮物，则可将血清加入培养基内一起过滤，勿直接过滤血清。
3）瓶装(500ml) 血清解冻步骤(逐步解冻法)：–20℃或–70℃至4℃冰箱溶解一天，至室温下全溶后再分装，一般以50ml无菌离心管可分装40～45 ml。在溶解过程中须规则摇晃均匀(小心勿造成气泡)，使温度与成分均一，减少沉淀的发生。勿直接由–20℃直接至37℃解冻，因温度改变太大，容易造成蛋白质凝结而发生沉淀。

3.培养箱及其他仪器的检查与调试
1）CO2钢瓶之CO2压力。
2）CO2培养箱之CO2浓度（5%）、温度（37℃）、及更换水盘的无菌水（可添加消毒剂（Zephrin 1:750）每周更换）。
3）无菌操作台内之airflow压力，定期更换紫外线灯管及HEPA过滤膜，预滤网(300小时/预滤网，3000小时/HEPA)。
4. 其他试剂的配制及灭菌
4.1 PBS（PH7.4，1L）：称取8g NaCl、0.2g KCl、1.44g Na2HPO4和0.24g KH2PO4,溶于800ml蒸馏水中，用HCl调节溶液的pH值至7.4，最后加蒸馏水定容至1L即可0.01M 。高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，室温放冷，置于4℃或常温保存。
4.2 无菌水：双蒸水高压蒸汽灭菌121℃, 15 lb, 20 分钟，室温放冷，常温保存。

二、细胞传代培养
工作人员穿戴实验衣及手套进入无菌室，小心取用实验物品，避免造成污染。勿碰触吸管尖头部或是容器瓶口，亦不要在打开之容器正上方操作实验。容器打开后，以手夹住瓶盖并握住瓶身，倾斜约45°角取用，尽量勿将瓶盖盖口朝上放置桌面。对于来自人类或是病毒感染之细胞株应特别小心操作，并选择适当等级之无菌操作台（至少Class II）。操作过程中，应避免引起aerosol之产生，小心毒性药品，例如DMSO及TPA等，并避免尖锐针头之伤害等。
细胞生长至高密度时，即须分殖至新的培养瓶中，一般稀释比例为1:3 至1:6，依细胞种类而异。具体步骤：
粘附细胞：
1. 吸掉旧培养液。
2. 用PBS洗涤细胞一至二次。
3. 加入trypsin-EDTA 溶液(1ml/25cm2, 2ml/75cm2)，37℃作用数分钟，于倒立显微镜下观察，当细胞将要分离而呈现圆粒状时，吸掉trypsin-EDTA溶液。(若不移去trypsin-EDTA，则在trypsin-EDTA作用后，加入适量含血清之新鲜培养基终止trypsin作用，离心后再吸掉上清液)。
4. 轻拍培养瓶使细胞自瓶壁脱落，加入适量之新鲜培养基，以吸管上下吸放数次以打散细胞团块，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。
悬浮细胞：
1. 吸出细胞培养液，放入离心管中，离心1000 rpm 5 分钟。
2. 吸掉上清液，加入适量之新鲜培养基，混和均匀后，依稀释比例转移至新的培养瓶中，以正常培养条件培养。

三、细胞冷冻保存
步骤：
1. 冷冻前一日前更换半量或全量培养基，观察细胞生长情形。
2. 配制冷冻保存溶液(使用前配制)：将DMSO加入新鲜培养基中，最后浓度为5-10％，混合均匀，置于室温下待用。
3. 按细胞传代培养操作，收集培养之细胞，取少量细胞悬浮液((约0.1 ml)计数细胞浓度及冻前存活率。
4. 离心，去除上清液，加入适量冷冻保存溶液，使细胞浓度为1-5 x 10⁶ cells/ml，混合均匀，分装于已标示完全之冷冻保存管中，1 ml/vial，并取少量细胞悬浮液作污染检测。
5. 冷冻保存方法1: 冷冻管置于4℃ 10 分钟→ -20℃ 30分钟→ -80℃ 16～18小时(或隔夜)→液氮槽vapor phase长期储存。
6. 冷冻保存方法2: 冷冻管置于含异丙醇的程序降温盒中，直接放入-80℃，1～2天后再放入液氮槽中。

细胞类型	冻存浓度（cells/ml）
normal human fibroblast	1~3*106
hybridoma	1~3 x 106
adherent tumor lines	5~7 x 106
HeLa	1-3 x 106
other suspensions	5~10 x 106

注意事项：
1. 欲冷冻保存的细胞应在生长良好且存活率高之状态，约为80–90％致密度。
2. 冷冻前检测细胞仍保有其特有性质。
3.冷冻保护剂DMSO应为试剂级等级，无菌且无色，以5~10 ml小体积分装，4℃避光保存，勿作多次解冻。Glycerol 亦应为试剂级等级，以高压蒸汽灭菌后避光保存。在开启后一年内使用，因长期储存后对细胞会有毒性。
4. 冷冻保护剂浓度为5或10％ DMSO，若是不确定细胞之冷冻条件，在做冷冻保存之同时，亦应作一个backup culture，以防止冷冻失败。

四、细胞复苏
步骤：
1. 从液氮容器中取出冻存管，直接浸入37℃温水中，并不时摇动令其尽快融化。
2. 从37℃水浴中取出冻存管，打开盖子，用吸管吸出细胞悬液，加到离心管并滴加10倍以上培养液，混匀；
3. 离心， 1000rpm，5min；
4. 弃去上清液，加入含10%小牛血清培养液重悬细胞，计数，调整细胞密度，接种培养瓶，37℃培养箱静置培养；
5. 次日更换一次培养液，继续培养。
注意事项：
1 操作人员应戴防护面罩及手套，防止冷冻管可能爆裂之伤害。
2 自液氮或干冰容器中取出冷冻管，检查盖子是否旋紧，由于热胀冷缩过程，此时盖子易松掉。
3 将新鲜培养基置于37℃水槽中回温，回温后喷以70 % 酒精并擦拭之，移入无菌操作台内。
五、细胞计数与存活测试
1.存活测试之步骤为dye exclusion，利用染料会渗入死细胞中而呈色，而活细胞因细胞膜完整，染料无法渗入而不会呈色。一般使用蓝色之trypan blue染料，如果细胞不易吸收trypan blue，则用红色之Erythrosin bluish。
2. 步骤：
2.1. 取50µl细胞悬浮液与50µl trypan blue (or Erythrosin bluish)等体积混合均匀于1.5ml小离心管中。
2.2. 取少许混合液(约15µl) 自细胞计数版上方凹槽加入，于100倍倒立显微镜下观察，或于细胞计数仪中自动检测活细胞不染色，死细胞则为蓝色(或红色- Erythrosinbluish)。
2.3. 计数四个大方格之细胞总数，再除4，乘以稀释倍数(至少乘以2，因与trypan blue等体积混合)，最后乘以10⁴，即为每ml中细胞悬浮液之细胞数。若细胞位于线上，只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。
4 大格*细胞总数x 2 x 10⁴/4= 细胞数/m