首先siRNA由于只 …
阅读更多 »测序正确是不是说明shRNA构建没有问题
测序正确是一个重要的验证步骤,但它不能完全说明shRNA构建没有问题。下面我会具体说明为什么。 测序正确说明了什么? shRNA序列(包括发夹结构、目标序列)与设计一致: 如果你对构建后的质粒进行了Sanger测序,序列结果和你设计的shRNA完全一致,这说明你的克隆步骤(连接、转化等)是成功的。这意味着你至少在DNA水平上构建了正确的序列结构。 但这并不代 …
阅读更多 »免疫共沉淀:当细胞在 …
阅读更多 »测序正确是一个重要的验证步骤,但它不能完全说明shRNA构建没有问题。下面我会具体说明为什么。 测序正确说明了什么? shRNA序列(包括发夹结构、目标序列)与设计一致: 如果你对构建后的质粒进行了Sanger测序,序列结果和你设计的shRNA完全一致,这说明你的克隆步骤(连接、转化等)是成功的。这意味着你至少在DNA水平上构建了正确的序列结构。 但这并不代 …
阅读更多 »这是一个很重要也很实际的问题——瞬时转染效率是RNA干扰或质粒表达实验中一个关键变量,但很多人低估了它对结果的影响。 问题核心: 你说得非常对: “荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致。” 用荧光镜看确实是定性评估,不够准确,且不同组别(尤其不同处理条件)可能转染效率不同,导致后续敲低效率、蛋白表达等结果不具可比性。 几种常见的转染效率评估 …
阅读更多 »你遇到的这个问题在慢病毒(lentivirus)介导的RNA干扰实验中其实挺常见,下面我们逐步分析下可能的原因: 实验现象简述: siRNA转染敲得很有效(蛋白水平明显降低); **将siRNA序列构建进慢病毒(shRNA形式)**后感染细胞; 荧光表达很强(说明病毒成功进入细胞,且有表达); 但目标蛋白并未敲低,几乎没有 knockdown 效果。 可能原 …
阅读更多 »可以,但得分情况来看: 如果质粒是线性化了(即被酶切成线状DNA): 可以电转,但是效率明显低于超级螺旋质粒(超螺旋 plasmid,通常是未切割、天然状态下的质粒结构)。 线性质粒在细胞内容易被核酸酶降解,稳定性和转化成功率比超螺旋质粒低很多。 有些时候,比如做基因组编辑(CRISPR knock-in)、整合型表达载体(需要基因组插入时),反而故意使用线 …
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