2025年 5 月 13日, 星期二
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请问瞬时转染的效率如何确定?荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致

这是一个很重要也很实际的问题——瞬时转染效率是RNA干扰或质粒表达实验中一个关键变量,但很多人低估了它对结果的影响。 问题核心: 你说得非常对: “荧光镜下看感觉无法量化和保证每个组别的转染效率完全一致。” 用荧光镜看确实是定性评估,不够准确,且不同组别(尤其不同处理条件)可能转染效率不同,导致后续敲低效率、蛋白表达等结果不具可比性。 几种常见的转染效率评估 …

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siRNA转染很有效(蛋白水平明显降低),将siRNA序列构建进慢病毒(shRNA形式)后感染细胞,荧光表达很强,但目标蛋白并未敲低,这是什么原因

你遇到的这个问题在慢病毒(lentivirus)介导的RNA干扰实验中其实挺常见,下面我们逐步分析下可能的原因: 实验现象简述: siRNA转染敲得很有效(蛋白水平明显降低); **将siRNA序列构建进慢病毒(shRNA形式)**后感染细胞; 荧光表达很强(说明病毒成功进入细胞,且有表达); 但目标蛋白并未敲低,几乎没有 knockdown 效果。 可能原 …

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质粒被酶切过还可以电转吗?

可以,但得分情况来看: 如果质粒是线性化了(即被酶切成线状DNA): 可以电转,但是效率明显低于超级螺旋质粒(超螺旋 plasmid,通常是未切割、天然状态下的质粒结构)。 线性质粒在细胞内容易被核酸酶降解,稳定性和转化成功率比超螺旋质粒低很多。 有些时候,比如做基因组编辑(CRISPR knock-in)、整合型表达载体(需要基因组插入时),反而故意使用线 …

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大肠杆菌电转后,4度涂抹到培养基板子上会导致死亡吗?细菌电转后是不是比细胞还脆弱啊?

这个问题问得很实际,也很关键,特别是在做质粒转化实验的时候容易遇到。 回答一:大肠杆菌电转后,4℃下操作是否会导致死亡? 不会直接导致大面积死亡,但确实会影响转化效率。 电转后的大肠杆菌处于一种“受伤”的状态,细胞膜被电击短暂打破,虽然迅速恢复,但暂时很脆弱。 如果在电转后没有及时给予复苏(比如在SOC、LB等液体培养基中摇床复苏30–60分钟),就直接在低 …

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